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Tipo: Dissertação
Título: Padronização de PCR para detecção direta e diferenciação de espécies de Campylobacter em Queijo Minas Artesanal
Autor(es): Gonçalves, Amanda Gonelli
Primeiro Orientador: Silva, Márcio Roberto
Co-orientador: Ribeiro, João Batista
Co-orientador: Húngaro, Humberto Moreira
Membro da banca: Teodoro, Vanessa Aglaê Martins
Resumo: O Queijo Minas Artesanal (QMA) é um dos mais antigos e tradicionais queijos do Brasil e contribui para a geração de renda de diversos produtores rurais. Sua produção é caracterizada pela utilização de leite cru recém-ordenhado. Embora muito popular, o QMA nem sempre apresenta inocuidade suficiente, tornando-se necessário intensificar a demanda por estudos mais representativos sobre a segurança microbiológica deste produto. Campylobacter spp. tem sido o patógeno mais frequentemente associado a surtos de doenças de origem alimentar em todo o mundo nos últimos anos, entretanto, é um patógeno negligenciado em estudos de prevalência e nos critérios microbiológicos na legislação para queijos no Brasil. A detecção de Campylobacter spp. por métodos clássicos de identificação é de difícil execução e pode apresentar significativas variações nos resultados obtidos. Os métodos moleculares, em especial a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) são ferramentas promissoras para a rápida e direta detecção de Campylobacter spp. em alimentos, devido sua alta especificidade, sensibilidade e bom limite de detecção. O objetivo deste trabalho foi padronizar uma metodologia molecular baseada em PCR multiplex para identificação direta de Campylobacter spp. e diferenciação das espécies Campylobacter jejuni e Campylobacter coli em QMA do Serro. A PCR multiplex foi desenvolvida utilizando iniciadores 16S rRNA, hipO e ceuE, específicos para a detecção de Campylobacter spp., C. jejuni e C. coli, respectivamente. Para a padronização da metodologia foram testadas 5 combinações variando-se as concentrações de MgCl2 (1,0μ L/2,0μ L), tampão (2,5μ L/3,5μ L), DNA (10μ L/5μ L), agarose (1,0%/1,5%), além de modificações na voltagem (120V/80V) e temperatura de anelamento (66°C/62°C). A partir da padronização, realizou-se avaliação do limite de detecção (LD), utilizando as concentrações de 0,1, 10, 103 e 105 UFC/g. Testes com enzimas de restrição XhoI, HhaI e HindIII foram realizados para gerar evidência adicional sobre a seletividade do método. Também foi avaliada a presença de Campylobacter spp. em amostras de campo. A PCR multiplex padronizada mostrou ser um método rápido e efetivo na detecção de Campylobacter spp., C. jejuni e C. coli em amostras de QMA artificialmente contaminadas. O LD foi estimado em 103 UFC/mL. Os testes com as enzimas de restrição confirmaram a seletividades dos primers. Ao avaliar a presença deste patógeno em amostras de campo, houve inconsistência nos resultados utilizando a PCR multiplex. O método mostrou-se efetivo para a detecção de Campylobacter spp. no queijo artificialmente contaminado e inconsistente para a pesquisa deste patógeno em amostras de campo, o que pode ser explicado pelo LD. Como perspectiva futura, foi proposto implementar a etapa de enriquecimento seletivo das amostras para elevar a sensibilidade do método, bem como validação da metodologia para avaliar a especificidade da PCR.
Abstract: The Artisanal Minas Cheese (AMC) is one of the oldest and most traditional cheeses in Brazil and it contributes to the income generation of several rural producers. The production of artisanal minas cheese is characterized using raw milk freshly milked. Although very popular, artisanal minas cheese does not always present sufficient innocuousness, requiring intensifying the demand for more representative studies about microbiological safety of this product. Campylobacter spp. has been the most frequently pathogen associated with outbreaks of foodborne diseases worldwide in recent years, however it is a neglected pathogen in prevalence studies and in the microbiological standards for cheeses in the Brazilian legislation. The detection of Campylobacter spp. by conventional methods of identification is difficult to perform and may present significant variations in the results. Molecular methods, especially Polymerase Chain Reaction (PCR) are promising tools for the rapid and direct detection of Campylobacter spp. in food, due to its high specificity, sensitivity and good detection limit. The aim of this work was to develop a molecular methodology based on multiplex PCR for direct identification of Campylobacter spp. and differentiation of the species C. jejuni and C. coli in AMC from Serro. Multiplex PCR was developed using the primers 16S rRNA, hipO and ceuE, specific for the detection of Campylobacter spp., C. jejuni and C. coli, respectively. In order to develop the methodology, 5 reaction combinations were tested, with different concentrations of MgCl2 (1,0μL/2,0μ L), buffer (2,5μ L/3,5μ L), DNA(10μ L/5μ L), agarose gel (1,0%/1,5%), besides modifications in voltage of electrophoretic running (120V/80V) and anneling temperature (66°C/62°C). The detection limit (DL) was evaluated using the concentrations: 0,1, 10, 103 and 105 CFU/ml. Tests with restriction enzymes XhoI, HhaI and HindIII were performed to provide additional evidence about the selectivity of the method. The Campylobacter spp. presence in field samples was also evaluated. The multiplex PCR developed in this work has been shown to be a rapid and effective method for the detection of Campylobacter spp., C. jejuni and C. coli in artificially contaminated AMC samples. DL was estimated at 103 CFU/mL. Tests with the restriction enzymes confirmed the selectivity of the primers. When evaluating the presence of this pathogen in field samples, there was inconsistency in the results using multiplex PCR. The method was effective for the detection of Campylobacter spp. in the artificially contaminated samples and inconsistent for field samples, which can be explained by DL. As a future perspective, it was proposed to implement the selective enrichment step of the samples to improve the sensitivity of the method, as well as validation of the methodology to evaluate the PCR specificity.
Palavras-chave: Campylobacter spp.
PCR multiplex
Queijo Minas Artesanal
Serro
Campylobacter spp.
Multiplex PCR
Artisanal minas cheese
Serro
CNPq: CNPQ::CIENCIAS DA SAUDE::FARMACIA
Idioma: por
País: Brasil
Editor: Universidade Federal de Juiz de Fora (UFJF)
Sigla da Instituição: UFJF
Departamento: Faculdade de Farmácia
Programa: Mestrado Profissional em Ciência e Tecnologia do Leite e Derivados (EPAMIG)
Tipo de Acesso: Acesso Aberto
URI: https://repositorio.ufjf.br/jspui/handle/ufjf/8282
Data do documento: 30-Ago-2018
Aparece nas coleções:Mestrado Profissional em Ciência e Tecnologia do Leite e Derivados (Dissertações)



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