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Type: Tese
Title: Avaliação in vitro da resposta inflamatória e metabolismo lipídico de macrófagos em animais taurinos e zebuínos estimulados com saliva do carrapto Rhipicephalus microplus
Author: Paiva, Raquel Morais de
First Advisor: Machado, Marco Antônio
Co-Advisor: Carvalho, Wanessa Araújo
Referee Member: Viccini, Lyderson Facio
Referee Member: Almeida, Patrícia Elaine de
Referee Member: Verardo, Lucas Lima
Referee Member: Lage, Andrey Pereira
Resumo: O parasitismo pelo carrapato Rhipicephalus microplus gera grandes perdas na produção de carne e leite por bovinos, além de representar um perigo para a saúde única, tanto pela transmissão de doenças infecciosas quanto pela contaminação do alimento e meio ambiente por acaricidas, principal metodologia adotada por produtores para controle de infestações por esse ectoparasito hematófago. As características fenotípicas de resistência e susceptibilidade ao R. microplus são bem definidas entre as raças de bovinos zebuínas (Bos primigenius indicus) e taurinas (Bos primigenius taurus), respectivamente, constituindo uma herança genética multifatorial de herdabilidade variável. Diversos trabalhos já identificaram a participação da imunidade inata e resposta de macrófagos no desenvolvimento de resistência contra a infestação por carrapatos. Apesar disso, até o momento, pouco se sabe acerca dos diferentes fenótipos de macrófagos, M1 (atividade pró-inflamatória; indutor de padrão Th1) e M2 (atividade regulatória; indutor de Th2), e sua influência na resistência ao carrapato apresentado por animais taurinos e zebuínos. Nesse contexto, o presente trabalho visa caracterizar as vias metabólicas envolvidas na ativação de macrófagos de animais taurinos e zebuínos para identificação de potenciais alvos de reprogramação metabólica por imunomodulação e genes candidatos para programas de melhoramento genético bovino. Para tal, foi estabelecido um protocolo de diferenciação de macrófagos a partir de monócitos isolados de sangue periférico de animais taurinos (Holandês Preto e Branco) e zebuínos (Gir), in vitro. Essas células foram estimuladas com lipopolissacarídeo, um potente indutor de macrófagos M1, e saliva do carrapato R. microplus que, em condições de parasitismo, é inoculada no hospedeiro para modular a resposta imune e facilitar a hematofagia. O RNA de macrófagos diferenciados foi extraído e submetido ao sequenciamento em massa (RNA-Seq) para identificação de genes diferencialmente expressos (DEGs). Análises de ontologia gênica e rotas metabólicas demonstraram que macrófagos de animais zebuínos, sem estímulo, possuem uma maior ativação de genes ligados ao processamento e apresentação de antígenos, à ativação do fator de transcrição NFκB e ao controle indireto do ciclo celular através do metabolismo de lipídeos. Esse comprometimento com respostas mais próinflamatórias apresentado por macrófagos de animais zebuínos parece influenciar diretamente na ativação do fenótipo M1 via LPS com uma maior expressão de genes relacionados a síntese do óxido nítrico, de citocinas, como IL-1 e IL-36, além do fator NFκB2, que é responsável pelo controle da transcrição de moléculas com atividade próinflamatória. A saliva de R. microplus induziu diferenças significativas em vias de ativação da mitose e do potencial de membrana regulados pelo estresse oxidativo. Além disso, a saliva demonstrou capacidade de modular a expressão dos genes que codificam a enzima óxido nítrico sintase 2 (NOS2), o regulador negativo de espécies reativas de oxigênio (NRROS), e a citocina IL-10 em macrófagos estimulados com LPS, avaliados por PCR em tempo real. Esses resultados, em conjunto, permitiram indicar genes candidatos para resistência ao carrapato em programas de melhoramento genético bovino bem como processos biológicos chave, passíveis de modulação, para desenvolvimento de estratégias mais eficazes e menos poluentes de controle do carrapato.
Abstract: The parasitism caused by Rhipicephalus microplus tick generates large losses in meat and milk production by cattle, as well as representing a unique health hazard due to the transmission of infectious diseases and the contamination of food and environment caused by acaricides, the main methodology adopted by producers for this hematophagous ectoparasite control. The phenotypic features of resistance and susceptibility to R. microplus are well defined between the zebu (Bos primigenius indicus) and taurine (Bos primigenius taurus) cattle breeds respectively, constituting a multifactorial genetic inheritance of variable heritability. Several papers have already identified the role of innate immunity and macrophage response against ticks. Despite this, little is known about the different phenotypes of macrophages M1 (proinflammatory activity, Th1 inducer) and M2 (regulatory activity, Th2 inducer), and its influences on tick resistance presented by taurine and zebu cattle. In this context, the present work aims to characterize the metabolic pathways involved in the activation of taurine and zebu macrophages to identify potential targets for metabolic reprogramming by immunomodulation and candidate genes for bovine genetic improvement programs. For this purpose, a macrophage differentiation protocol was established from in vitro isolation of peripheral blood monocytes of taurine (Holstein) and zebu (Gir) animals. The cells were treated with lipopolysaccharide (LPS), a potent inducer of M1 macrophages, and R. microplus tick saliva, which under parasitism conditions, is inoculated into the host to modulate the immune response and facilitate hematophagy. The RNA of differentiated macrophages were extracted and submitted to high throughput sequencing (RNA-Seq) for the identification of differentially expressed genes (DEGs). Gene ontology and metabolic pathways analysis showed that zebu non-stimulating macrophages have a greater activation of genes linked to the antigen processing and presentation, the activation of the NFκB transcription factor and the indirect control of the cell cycle through lipid metabolism. This macrophages implication, with more proinflammatory responses for zebu animals, seems to directly influence the M1 phenotype activation via LPS with a greater expression of genes related with nitric oxide synthesis, cytokines, such as IL-1 and IL-36, besides the NFκB2 factor, responsible in controlling the pro-inflammatory molecules transcription. The saliva of R. microplus tick induced significant differences in mitotic activation pathways and membrane potential regulated by oxidative stress. In addition, saliva demonstrated the ability in modulating the expression of genes encoding the nitric oxide synthase 2 enzyme (NOS2), the negative regulator of reactive oxygen species (NRROS), and the IL-10 cytokine in LPS-stimulated macrophages, evaluated by real time PCR. Taken together, these results, allowed us to identify candidate genes for tick resistance in breed genetic programs, as well as key biological process, which can be modulated for development of more effective strategies and less polluting tick control.
Keywords: Carrapato
Resistência
Bovino
NFκB
PTGDS
Tick
Resistance
Bovine
NFκB
PTGDS
CNPq: CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::GENETICA
Language: por
Country: Brasil
Publisher: Universidade Federal de Juiz de Fora (UFJF)
Institution Initials: UFJF
Department: ICB – Instituto de Ciências Biológicas
Program: Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas: Imunologia e Doenças Infecto-Parasitárias/Genética e Biotecnologia
Access Type: Acesso Embargado
URI: https://repositorio.ufjf.br/jspui/handle/ufjf/9985
Issue Date: 14-Mar-2019
Appears in Collections:Mestrado em Ciências Biológicas - Imunologia e Doenças Infecto - Parasitárias/Genética e Biotecnologia (Dissertações)



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