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Tipo: Dissertação
Título: Avaliação da ativação plaquetária e secreção de citocinas em resposta à proteína não estrutural 1 (NS1) do vírus da Dengue-2
Autor(es): Teixeira, Anna Cecíllia Quirino
Primeiro Orientador: Hottz, Eugenio Damaceno
Membro da banca: Gameiro, Jacy
Membro da banca: Viola, Patricia Torres Bozza
Resumo: A dengue é uma doença causada pelo vírus da dengue (DENV), composto por 4 sorotipos, sendo transmitida pela picada do mosquito Aedes aegypti, principalmente. Alguns pacientes podem desenvolver uma forma grave da doença, chamada de dengue grave, caracterizada por extravasamento vascular, hemorragia grave e falência dos órgãos. Inflamação exacerbada com concentrações elevadas de citocinas inflamatórias contribuem para o extravasamento vascular e a gravidade da dengue. Estudos recentes demonstraram altos níveis da proteína não estrutural 1 (NS1) do DENV no sangue dos pacientes com dengue grave. A NS1 está relacionada à interação com TLR4 em macrófagos, induzindo a secreção de mediadores inflamatórios, e à ruptura do endotélio vascular, contribuindo para o extravasamento vascular. Apesar de a interação da NS1 com macrófagos e células endoteliais já ter sido demonstrada, sua habilidade em ativar plaquetas ainda é desconhecida. Nesse estudo, plaquetas de voluntários saudáveis foram estimuladas com NS1 do DENV2 recombinante e a resposta plaquetária foi avaliada por citometria de fluxo e ELISA. Nós observamos que a NS1 do DENV2 recombinante produzida em E. coli aumentou a ativação plaquetária, indicada pela expressão da P-selectina (CD-62P) na superfície. Nossos resultados indicam que a NS1 aumenta a secreção das quimiocinas RANTES/CCL5 e PF4/CXCL4 e das citocinas pró-inflamatórias IL-1α e MIF. Contudo, não houve aumento nos níveis da citocina antinflamatória TGF-β. O pré-tratamento com polimixina B não afetou a habilidade da NS1 em induzir a translocação da P-selectina e secreção de citocinas, indicando ausência de contaminação por LPS. Além disso, pré-exposição a NS1 potencializou a ativação plaquetária e secreção de quimiocinas em resposta a uma concentração sub-ótima de trombina. As plaquetas também foram estimuladas com NS1 produzida em células HEK e os resultados obtidos demonstraram um aumento na expressão superficial de P-selectina, confirmando os dados anteriores de que a NS1 do DENV2 promove ativação plaquetária. Posteriormente, plaquetas de voluntários saudáveis pré-tratadas com anticorpos neutralizantes anti-TLR4 ou IgG inespecífica foram estimuladas com NS1 produzida em células HEK . Nossos resultados demonstram que a NS1 ativa plaquetas parcialmente através do receptor TLR4. Finalmente, nós demonstramos que plaquetas infectadas com DENV além de replicarem o RNA viral, são capazes de traduzir o genoma do vírus, sintetizando NS1. No entanto, nossos resultados mostram que as plaquetas não secretam partículas virais, indicando que o ciclo de replicação do vírus não é completo. Apesar dessa replicação abortiva, as plaquetas são capazes de secretar a NS1, que pode agir como um PAMP induzindo respostas imuno-inflamatórias. Nossos dados demonstram que NS1 do DENV2 é capaz de ativar plaquetas, induzindo a secreção de mediadores inflamatórios. Somado a isso, NS1 do DENV2 potencializa a ativação plaquetária pela trombina, sugerindo uma intensificação da resposta tromboinflamatória. Nossos resultados indicam que as plaquetas não só respondem a NS1 exógena como também são fontes de NS1 durante a infecção pelo DENV. Em conjunto, estes eventos podem potencialmente contribuir para a patogênese da dengue.
Abstract: Dengue is a disease caused by dengue virus (DENV), composed by 4 serotypes, and transmitted mostly by Aedes aegypti mosquitos. Some patients may develop a severe form of the disease, called severe dengue, characterized by vascular leakage, severe hemorrhage and organ failure. High concentrations of inflammatory cytokines in the blood of dengue patients contribute to vascular leakage and dengue severity. Recent studies have shown high plasma levels of the non-structural protein 1 (NS1) in the blood of dengue patients. NS1 has been related to interaction with TLR4 on macrophages, inducing the secretion of proinflammatory mediators, and to the disruption of the vascular endothelium, contributing to vascular leakage. Although interactions of NS1 with macrophages and endothelial cells have already been demonstrated, its ability to activate platelets is still unclear. Platelets from healthy volunteers were stimulated with recombinant DENV-2 NS1 produced in E. coli and platelet responses evaluated by flow cytometry and ELISA. We observed that DENV-2 NS1 increased platelet activation as indicated by P-selectin surface expression. Our results indicate that NS1 increases the secretion of the chemokines RANTES/CCL5 and PF4/CXCL4 and the proinflammatory cytokines IL-1α and MIF. However, there was no increase in the levels of the anti-inflammatory cytokine TGF-β. Treatment with polymixin B did not affect the ability of NS1 to induce P-selectin translocation and cytokine secretion, indicating the absence of LPS contamination. In addition, pre-exposure to NS1 potentiated platelet activation and chemokine secretion in response to a suboptimal concentration of thrombin. Platelets were also stimulated with recombinant NS1 produced in HEK cells and the results show a similar increase in the surface expression of P-selectin, confirming previous data in which DENV2 NS1 promotes platelet activation. Furthermore, platelets from healthy volunteers were incubated with anti-TLR4 neutralizing antibodies or control IgG and then stimulated with NS1 produced in HEK cells. Our data shows that NS1 activates platelets partially depending on TLR4. Finally, we demonstrated that DENV-infected platelets replicated viral RNA, as quantified by qPCR, and also expressed and secreted NS1, as detected by western blot of pellets and supernatants of infected platelets. However, although DENV2-infected platelets are not able to secrete viral particles, promoting abortive replication, they secrete NS1, which may act as a PAMP inducing immune-inflammatory responses. Our data demonstrate that DENV NS1 is capable of activating platelets inducing the release of pro-inflammatory mediators. Besides, DENV NS1 potentiates platelet activation by thrombin, suggesting an intensification of the thromboinflammatory response. Our data also indicate that platelets not only respond to exogenous NS1 but also are a source of NS1 during DENV infection.
Palavras-chave: Vírus da dengue
Ativação plaquetária
NS1
Citocinas pró-inflamatórias
Replicação viral
Dengue virus
Platelet activation
NS1
Proinflammatory cytokines
Viral replication
CNPq: CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::IMUNOLOGIA
Idioma: por
País: Brasil
Editor: Universidade Federal de Juiz de Fora (UFJF)
Sigla da Instituição: UFJF
Departamento: ICB – Instituto de Ciências Biológicas
Programa: Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas: Imunologia e Doenças Infecto-Parasitárias/Genética e Biotecnologia
Tipo de Acesso: Acesso Aberto
URI: https://repositorio.ufjf.br/jspui/handle/ufjf/9802
Data do documento: 7-Fev-2019
Aparece nas coleções:Mestrado em Ciências Biológicas - Imunologia e Doenças Infecto - Parasitárias/Genética e Biotecnologia (Dissertações)



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