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Type: Dissertação
Title: Polissacarídeos sulfatados da alga verde Ulva lactuca L.: caracterização química parcial e análise das atividades anticoagulante, antitrombótica e anti-inflamatória
Author: Reis, Samara Evangelista
First Advisor: Medeiros, Valquíria Pereira de
Referee Member: Motta, Guacyara da
Referee Member: Rocha, Fabiola Dutra
Resumo: As doenças cardiovasculares, entre as quais se incluem as desordens trombóticas, estão entre as principais causas de mortalidade no mundo. A heparina é um polissacarídeo sulfatado de origem animal utilizado mundialmente como um agente terapêutico (anticoagulante e antitrombótico). Os polissacarídeos sulfatados (PS) de algas marinhas possuem estruturas complexas, o que tem tornado interessante os estudos de suas possíveis atividades biológicas. No presente trabalho, PS das algas Ulva lactuca L. (Ul) e Fucus vesiculosus L. (Fv) foram extraídos por proteólise enzimática, seguida de fracionamento com diferentes volumes de acetona. As frações obtidas foram, inicialmente, analisadas por eletroforese em gel de agarose. Os teores de proteínas, açúcares totais, ácidos urônicos e sulfato foram determinados por dosagens químicas e o peso molecular foi determinado por eletroforese em gel de agarose. A composição monossacarídica foi determinada por Fluorophore Assisted Carbohydrate Electrophoresis (FACE) e por cromatografia em papel. Além disso, foram realizadas análises espectroscópicas por FT-IR/ATR e Raman. A atividade anticoagulante foi investigada por testes in vitro TTPa, TP, TT e ensaios cromogênicos (anti-fatores Xa e IIa). A atividade antitrombótica foi avaliada in vivo pelo modelo da ligadura da veia cava inferior em ratos Wistar e in vitro, pela dosagem de NO e pela dosagem da atividade de metaloproteinases em cultura de células de aorta de coelho (RAEC). A atividade anti-inflamatória foi investigada pela dosagem de NO, citocinas (IL-6 e TNF-α) e metaloproteinases em cultura de macrófagos (RAW 264.7). As frações F50Ul, F70Ul, F50Fv e F70Fv apresentaram bandas na eletroforese em gel de agarose com metacromasia e padrão de migração característicos da presença de polissacarídeos sulfatados, levando a seleção dessas frações para análises posteriores. A análise da composição química revelou a presença de polissacarídeos ricos em sulfato e carboxila, o que foi confirmado pelas análises espectroscópicas. Os PS apresentaram elevado peso molecular, sendo que as frações de U. lactuca L. apresentaram como principal monossacarídeo a ramnose, além de glicose, galactose e ácidos urônicos, enquanto as frações de F. vesiculosus L., apresentaram fucose, glicose e ácidos urônicos. As frações F50Ul e F50Fv, F70Fv prolongaram o TTPa (0,1-1,0 μg/mL) e inibiram a atividade dos fatores Xa e IIa (1 μg/mL). Além disso, essas frações (20 μg/g), apresentaram efeito antitrombótica in vivo após 24 horas de ação. F50Ul mostrou melhor atividade nas concentrações 5-10 μg/g e apresentou um efeito tempo dependente, com inibição completa da formação de trombos decorridas 12 horas de ação (10 μg/g). Na avaliação in vitro F50Ul (25-100 μg/mL) aumentou a produção de NO pelas células endoteliais de aorta de coelho, sendo que após 12 horas de incubação esse aumento ocorreu de forma mais significativa. Em cultura de células RAW 264.7, os PS das algas foram capazes de interferir na produção de NO, interleucinas e metaloproteinases, sendo que F50Fv e F70Fv inibiram a resposta inflamatória, enquanto F50Ul estimulou o aumento destes mediadores. Os resultados obtidos sugerem atividades importantes para os PS de U. lactuca L. o que permite propor a continuação dos estudos para melhor entendimento dos mecanismos de ação envolvidos, bem como de suas estruturas.
Abstract: Cardiovascular diseases, including thrombotic disorders, are among the leading causes of mortality in the world. Heparin is a sulfated polysaccharide of animal origin used worldwide as a therapeutic agent (anticoagulant and antithrombotic). Sulfated polysaccharides (SP) of seaweed have complex structures, which have become interesting studies of their possible biological activities. In this study, SP from Ulva lactuca L. (Ul) and Fucus vesiculosus L. (Fv) were extracted by enzymatic proteolysis, followed by fractionation with different volumes of acetone. The fractions obtained were initially analyzed by agarose gel electrophoresis. The amounts of proteins, total sugars, uronic acids, and sulfate were determined by chemical dosages, and molecular weight was determined by agarose gel electrophoresis. Monosaccharide composition was determined by Fluorophore-assisted Carbohydrate Electrophoresis (FACE) and by paper chromatography. Also, analyses were made by FTIR/ATR and Raman spectroscopy. Anticoagulant activity was investigated in vitro by TTPa, TP, TT and by chromogenic assays (anti-factor Xa and IIa). Antithrombotic activity was evaluated in vivo by cava vein ligation model in rats and in vitro by measurement of NO production and metalloproteinase activity dosage in rabbit aorta cells culture (RAEC). Anti-inflammatory activity was investigated by measurement of NO, cytokines (IL-6 and TNF-α) and metalloproteinases in macrophage culture (RAW 264.7). F50Ul, F70Ul, F50Fv and F70Fv fractions presented bands with metachromasia and a migration pattern in agarose gel electrophoresis characteristic of the presence of sulfated polysaccharides led to the selection of fractions for further analyses. Chemical composition analysis revealed the presence of polysaccharides rich in sulfate and carboxyl, which was confirmed by spectroscopic analyses. SP had a high molecular weight, and U. lactuca L. fractions present rhamnose as major monosaccharide constituent, and glicose, galactose and uronic acids were also present., while F. vesiculosus L. fractions presented fucose, glicose and uronic acids. F50Ul, F50Fv and F70Fv fractions prolonged the TTPa (0.1-1.0 μg/mL) and inhibited Xa and IIa factors activity (1μg/ml). Also, these fractions (20 μg/g) showed in vivo antithrombotic effect after 24 hours of action. F50Ul showed higher activity at concentrations (5-10 μg/g) and showed a time-dependent effect, with a complete inhibition of thrombus formation after 12 hours of action (10 μg/g). In vitro evaluation, F50Ul (25-100 μg/mL) increased NO production by rabbit aortic endothelial cells and after 12 hours of incubation, this increase was more significantly. In RAW 264.7 cells culture, SP algae were able to interfere with NO production, interleukins, and metalloproteinases, and F50Fv and F70Fv inhibited inflammatory responses, while F50Ul stimulated the increase of these mediators. The results suggest important activities for U. lactuca L. SP and allowing propose further study to understand better the mechanisms involved, as well as their structures.
Keywords: Ulva lactuca L.
Polissacarídeos sulfatados
Anticoagulante
Antitrombótica
Anti-inflamatória
Ulva lactuca L.
Sulfated polysaccharides
Anticoagulant
Antithrombotic
Anti-inflammatory
CNPq: CNPQ::CIENCIAS DA SAUDE::FARMACIA
Language: por
Country: Brasil
Publisher: Universidade Federal de Juiz de Fora (UFJF)
Institution Initials: UFJF
Department: Faculdade de Farmácia
Program: Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas
Access Type: Acesso Aberto
URI: https://repositorio.ufjf.br/jspui/handle/ufjf/8467
Issue Date: 29-Jul-2016
Appears in Collections:Mestrado em Ciências Farmacêuticas (Dissertações)



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