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Clase: Tese
Título : Caracterização molecular e imunológica da nucleosídeo trifosfato difosfohidrolase (NTPDASE 1) de Leishmania amazonensis e de seu domínio B
Autor(es): Detoni, Michelle de Lima
Orientador: Vasconcelos, Eveline Gomes
Miembros Examinadores: Faria, Suzana Côrte-Real
Miembros Examinadores: Valle, Tânia Zaverucha do
Miembros Examinadores: Pinto, Priscila de Faria
Miembros Examinadores: Cupolilo, Sônia Maria Neumann
Resumo: Por análises in silico, um domínio B conservado e antigênico foi previamente identificado em nucleosídeo trifosfato difosfohidrolases (NTPDases) de plantas e parasitos. O r-potDomB, um recombinante derivado do domínio B (r78-117) da apirase de batata, foi obtido por expressão heteróloga, e a sua reatividade com anticorpos policlonaisanti-apirase de batata confirmaram a existência de epitopos indutores de resposta imune humoral em mamíferos. A clonagem do gene da NTPDase1 de Leishmania amazonensis (LamNTPDase1; NCBI: AFJ22627.1) e as análises in silico reforçaram a hipótese de conservação do domínio B de NTPDases. O r-potDomB, os peptídeos sintéticos LbB1LJ e LbB2LJ derivados do domínio B de NTPDase1 de Leishmania, e os anticorpos produzidos contra estas biomoléculas, foram usados como ferramentas moleculares para estudos específicos da NTPDase1 de L. amazonensis e da leishmaniose. Por “Western blots”, a NTPDase1 foi identificada como bandas de 48 e 63 kDa em frações de membrana, microssomal e flagelo de promastigotas. Por análise imunocitoquímicaultraestrutural, os anticorpos localizaram a NTPDase1 na superfície de membrana plasmática, núcleo, mitocôndria e cinetoplasto, bolsa flagelar e flagelo, confirmando sua ampla distribuição neste parasito. Análises in silico sugeriram as possíveis modificações pós-traducionais da NTPDase1, incluindo a sua conjugação com proteína SUMO. Os polipeptídeos de 48 e 63 kDa e um co-migrante de 12 kDa foram isolados de promastigotas por eletroforese em gel não-desnaturante. Por “Western blots” e espectrometria de massas, a identidade da NTPDase1 foi confirmada nospolipeptídeos de 48 e 63 kDa. Por espectrometria de massas, o polipeptídeo de 12 kDa foi identificado como pertencente à família de proteínas SUMO e, também, adicionado aopolipeptídeo de 63 kDa. Os polipeptídeos de 63 kDa e 12 kDa, mas não o de 48 kDa, foram reconhecidos em “Western blots” pelo soro imune anti- SUMO1, sugerindo a ligação entre NTPDase1 e SUMO, uma modificação descrita pela primeira vez entre os membros da família das NTPDases. Camundongos BALB/c foram infectados com promastigotas, e os anticorpos destes animais reconheceram a NTPDase1 pura, mas não SUMO, confirmando sua antigenicidade. Durante a progressão da doença, alta reatividade entre r-potDomB, LbB1LJ ou LbB2LJ e anticorpos IgG2a dos camundongos infectados foi observada aos 40 dias pós-infecção, revelando a antigenicidade do domínio B e a sua habilidade de induzir a produção deste subtipo nos estágios iniciais da doença. A reatividade de IgG1 foi significativamente maior aos 90-120 dias pós-infecção, coincidindo com o estágio mais ativo da doença, sugerindo participação do domínio em eventos imunoregulatórios. O r-potDomB induziu reação de hipersensibilidade tardia em camundongos Suíços, uma resposta imune celular, com elevação concomitante dos níveis de IgG2a e IFN-y. O r-potDomB, na ausência de adjuvante, usado na préimunização de camungondos Suíços infectados com amastigotas, estimulou a produção de IgG2a e IFN-y, e promoveu proteção parcial contra a progressão da leishmaniose como observado por medida de edema de patas e análises histopatológicas.Os resultados estimulam o aproveitamento biotecnológico do rpotDomB, ou derivados desta biomolécula, em formulações e em protocolos experimentais de imunoterapia e/ou vacinação contra leishmanioses.
Resumen : By in silico analysis, an antigenic conserved B domain was previously identified within nucleoside triphosphate diphosphohydrolases (NTPDases) of plants and parasites. The r-potDomB, a recombinant belonging to the conserved B domain (r78- 117) from the potato apyrase, was obtained by heterologous expression, and its reactivity with polyclonal anti-potato apyrase antibodies confirmed the existence of epitopes which induce humoral immune response in mammalian. The cloning of the gene from the Leishmania amazonensisNTPDase 1 (LamNTPDase1; NCBI AFJ22627.1) and in silico analysis reinforced the hypothesis of B-domain conservation within NTPDases. The r-potDomB, synthetic peptides LbB1LJ and LbB2LJ derived from the B-domain from LeishmaniaNTPDase 1, and the antibodies raised against these biomolecules, were used as molecular tools for specific studies of the L. amazonensisNTPDase 1 and leishmaniasis. By Western blots, theNTPDase 1 was identified as bands of 48 and 63 kDa in membrane, microsomal and flagellar fractions of promastigotes. By ultrastructural immunocytochemical, the antibodies localized the NTPDase 1 at the surface of plasma membrane, nucleus, mitochondria and kinetoplast, at flagellar pocket and flagellum, confirming its widespread distribution in this parasite. In silico analysis suggested possible post-translational modifications of the NTPDase 1, including its conjugation with SUMO protein. The polypeptides of 48 and 63 kDa and one co-migrant of 12 kDa were isolated of promastigotes by non-denaturing gel electrophoresis. By Western blots and mass spectrometry, the identity of NTPDase1 in the polypeptides of 48 e 63 kDa was confirmed. By mass spectrometry, the polypeptide of 12 kDa was identified belonging to the SUMO protein family and, also, added to the polypeptide of 63 kDa. The polypeptides of 63 and 12 kDa, but not 48 kDa, were recognized in Western blots by immune serum anti-SUMO1, suggesting binding between NTPDase 1 and SUMO, a modification described for the first time among members of the NTPDase family. BALB/c mice were infected with promastigotes, and the antibodies from these animals recognized the pure NTPDase, but not SUMO, confirming its antigenicity. During disease progression, high reactivity between r-potDomB, LbB1LJ or LbB2LJ and IgG2a antibodies of the promastigote-infected mice was observed at 40 days post-infection, revealing both the B-domain antigenicity and its ability for induce the production of this subtype in early disease stages. The IgG1 reactivity was significantly higher at 90-120 days post-infection, coinciding with the most active stage of the disease, suggesting participation of the domain in immuneregulatory events. The r-potDomB induced delayed type-hypersensitivity reaction in Swiss mice, a cellular immune response, with a concomitant increase in the levels of IgG2a and IFN-y. The r-potDomB, in the absence of adjuvant, used in pre-immunization of amastigotes-infected Swiss mice, stimulated the production of IgG2a and IFN-y, and promoted partial protection against leishmaniasis progression, as observed by measuring of footpad swelling and histopathological analysis. The results stimulate biotechnological use of the r-potDomB, or derivatives of this biomolecule, in formulations and experimental protocols of immunotherapy and/or vaccination against leishmaniasis.
Palabras clave : Apirase
SUMO
Domínio B
Leishmaniose
Antigenicidade
Apyrase
SUMO
B-domain
Leishmaniasis
Antigenicity
CNPq: CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS
Idioma: por
País: Brasil
Editorial : Universidade Federal de Juiz de Fora (UFJF)
Sigla de la Instituición: UFJF
Departamento: ICB – Instituto de Ciências Biológicas
Programa: Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas: Imunologia e Doenças Infecto-Parasitárias/Genética e Biotecnologia
Clase de Acesso: Acesso Aberto
URI : https://repositorio.ufjf.br/jspui/handle/ufjf/7001
Fecha de publicación : 30-mar-2015
Aparece en las colecciones: Doutorado em Ciências Biológicas - Imunologia e Doenças Infecto - Parasitárias/Genética e Biotecnologia (Teses)



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