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Type: Tese
Title: Efeito de bioisósteros do resveratrol complexados a metal em espécies de Leishmania associadas à leishmaniose cutânea e estudo do mecanismo de morte do parasito
Author: Machado, Patrícia de Almeida
First Advisor: Coimbra, Elaine Soares
Co-Advisor: Silva, Adilson David da
Referee Member: Vasconcelos, Eveline Gomes
Referee Member: Almeida, Patrícia Elaine de
Referee Member: Menna-Barreto, Rubem Figueiredo Sadok
Referee Member: Dias, Sílvia Regina
Resumo: As leishmanioses são doenças causadas por protozoários do gênero Leishmania, causando grande impacto na saúde pública mundial. O tratamento é limitado por uma série de fatores e a necessidade de alternativas para a quimioterapia é urgente. Assim, este trabalho teve como objetivo avaliar a atividade leishmanicida de bioisósteros do resveratrol e seus complexos metálicos e estudar o mecanismo de morte do parasito associado ao tratamento. Foram testados doze biosósteros do resveratrol, sendo cinco não complexados a metais, quatro complexados a ouro e três complexados a vanádio, em formas promastigotas e amastigotas de L. amazonensis, L. braziliensis e L. major e em macrófagos peritoneais. Para o teste em promastigotas e em macrófagos peritoneais, a viabilidade celular foi avaliada pelo método colorimétrico do MTT, enquanto no teste em amastigotas, o efeito dos compostos foi avaliado pela contagem das formas intracelulares. Foi ainda avaliada a seletividade e a especificidade dos compostos, através do cálculo do índice de seletividade e do índice de especificidade de cada composto. Os compostos complexados a metais, comparados aos não complexados, apresentaram significante efeito em promastigotas e amastigotas de Leishmania sp., e ainda foram seletivos ao parasito, em comparação com a célula hospedeira. Posteriormente, baseado na síntese, efetividade e seletividade, o composto 11 (VOSalophen), um complexo de vanádio, foi selecionado para estudos sobre mecanismos de morte e atividade em modelo de leishmaniose cutânea murina. Promastigotas de L. amazonensis tratadas com VOSalophen apresentam alterações mitocondriais, observados por meio das marcações com JC-1, Mitotracker® Red CM-H2XROS e rodamina 123 e da microscopia eletrônica de transmissão (MET); aumentam a produção de EROs (utilizando H2DCFDA), acumulam corpos lipídicos (marcação com Nile Red), apresentam alterações morfológicas, mas não alteram a integridade da membrana plasmática, visto não haver marcação com iodeto de propídeo. Além disto, os parasitos apresentam redução no tamanho celular e volume celular; externalização de fosfatidilserina na face externa da membrana plasmática do parasito (usando marcação com anexina V-FITC) e utilizando a técnica do TUNEL foi observada a fragmentação do DNA. Em amastigotas intracelulares de L. amazonensis, também foi verificada fragmentação do DNA (técnica TUNEL). O conjunto destes resultados sugere morte por apoptose-like. Além disso, foi verificado um aumento de formação de vacúolos autofágicos em promastigotas de L. amazonensis tratados com o VOSalophen (marcação com MDC e MET), sugerindo a ocorrência de autofagia. Em macrófagos infectados com L. amazonensis, VOSalophen induz um aumento de produção de ON e EROs, indicando modulação celular do composto em células infectadas. Em modelo de leishmaniose cutânea murina, o tratamento com o VOSalophen causou significativa redução da carga parasitária nas patas de camundongos BALB/c infectados com L. amazonensis, quando comparado ao controle e além disso, não mostrou toxicidade renal e hepática aos animais tratados, o que foi avaliado através das dosagens de AST, ALT, GGT e creatinina. Esses resultados, em conjunto, mostram o significante efeito in vitro e in vivo de bioisósteros do resveratrol complexados a metais.
Abstract: Leishmaniasis is diseases caused by protozoa of the genus Leishmania, causing significant impact on global public health. The treatment is limited by a number of factors, and the need for alternatives to chemotherapy is urgent. Thus, this study aimed to evaluate the leishmanicidal activity of bioisosters of resveratrol and its metal complexes and to study the mechanism of parasite death associated with the treatment. Twelve biosósteros of resveratrol were tested, five not complexed to metals, four complexed to gold and three complexed to vanadium, in promastigotes and amastigotes of L. amazonensis, L. braziliensis and L. major and in peritoneal macrophages. In promastigotes and peritoneal macrophages, the cell viability was assessed by the MTT colorimetric method, while in amastigotes, the effect of the compounds was evaluated by counting the intracellular forms. It was also assessed the selectivity and specificity of the compounds, by calculating the selectivity index and the specificity index of each compound. The compounds complexed to metals, compared to non-complexed, showed a significant effect on promastigotes and amastigotes of Leishmania sp., and were further selective to the parasite compared to the host cell. Subsequently, based on the synthesis, effectiveness and selectivity, the compound 11 (VOSalophen), a vanadium complex, was selected for studies on the mechanisms of death and activity in the murine model of cutaneous leishmaniasis. L. amazonensis promastigotes treated with VOSalophen exhibit mitochondrial alterations, which was observed by JC-1, Mitotracker® Red CMH2XROS e rhodamina 123 staining and transmission electronic microscopy (TEM); increased ROS production (using H2DCFDA); accumulate lipid bodies (Nile Red staining), exhibit morphological changes, but did not alter the integrity of the plasma membrane since no staining with propidium iodide. In addition, the parasites had a reduction in cell volume and size; phosphatidylserine externalization on the outer face of parasite's plasma membrane (annexin V-FITC staining) and using the TUNEL technique, DNA fragmentation was observed. In L. amazonensis intracellular amastigotes, DNA fragmentation was also observed (TUNEL technique). This set of results suggests death by apoptosis-like. Furthermore, there was an increase of autophagic vacuole formation in L. amazonensis promastigotes treated with VOSalophen (MDC staining and TEM), suggesting the occurrence of autophagy. In macrophages infected with L. amazonensis, VOSalophen induces an increase of nitric oxide and reactive oxygen species production, indicating a modulatory effect in infected cells. In the murine model of cutaneous leishmaniasis, the treatment with VOSalophen caused a significant reduction in the parasite load in the paws of BALB/c mice infected with L. amazonensis, when compared to control and furthermore not showed renal and hepatic toxicity to the treated animals, which was evaluated by the AST, ALT, GGT and creatinine dosages. These results, taken together, show the significant effect of bioisosters of resveratrol complexed to metals.
Keywords: Leishmania
Quimioterapia das leishmanioses
Resveratrol
Complexos metálicos
Apoptose-like
Autofagia
Leishmania
Chemotherapy of leishmaniasis
Resveratrol
Metal complexes
Apoptosis-like
Autophagy
CNPq: CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::IMUNOLOGIA
Language: por
Country: Brasil
Publisher: Universidade Federal de Juiz de Fora (UFJF)
Institution Initials: UFJF
Department: ICB – Instituto de Ciências Biológicas
Program: Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas: Imunologia e Doenças Infecto-Parasitárias/Genética e Biotecnologia
Access Type: Acesso Aberto
URI: https://repositorio.ufjf.br/jspui/handle/ufjf/4478
Issue Date: 20-Feb-2017
Appears in Collections:Doutorado em Ciências Biológicas - Imunologia e Doenças Infecto - Parasitárias/Genética e Biotecnologia (Teses)



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