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Clase: Dissertação
Título : Análise física e bioquímica de vesículas extracelulares isoladas com depleção de lipoproteínas plasmáticas
Autor(es): Merij, Laura Botelho
Orientador: Hottz, Eugenio Damaceno
Miembros Examinadores: Gameiro, Jacy
Miembros Examinadores: Trugilho, Monique Ramos de Oliveira
Resumo: Vesículas extracelulares (EVs) são pequenas vesículas membranosas liberadas por todos os tipos de células. As EVs são capazes de transportar diversas biomoléculas provenientes da célula parental e transferi-las para as células-alvo de forma objetiva. Assim, as EVs podem participar de vários processos biológicos mediando a comunicação celular, a resposta imune e a homeostase. Tentativas anteriores de isolar EVs do plasma mostraram contaminação por lipoproteínas, o que é um complicador nos estudos de EVs, uma vez que as lipoproteínas também podem modular respostas metabólicas e inflamatórias. Dessa forma, nosso objetivo foi padronizar protocolos para isolamento de EVs evitando contaminação por lipoproteínas. No primeiro trabalho abordado nessa dissertação apresentamos um protocolo padronizado por nosso grupo para a separação concomitante de EVs e lipoproteínas de baixa ou muito baixa densidade (LDLs ou VLDLs) do plasma através da ultracentrifugação de um gradiente de densidade (G-UC). No trabalho seguinte, avaliamos diferentes métodos para isolamento de EVs sem contaminação por lipoproteínas após a depleção das lipoproteínas por G-UC. Primeiramente, o plasma foi aplicado a G-UC para a depleção de lipoproteínas e foi então submetido a centrifugação seriada (SC) ou a uma coluna de cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) para isolamento das EVs. A análise e identificação da população de EVs foi feita por meio da análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) e citometria de fluxo. A ausência de lipoproteínas nas populações de EVs isoladas foi confirmada através da quantificação de colesterol e detecção da apolipoproteína B100 (apoB-100) por western blot. Complementarmente, realizamos análiseproteômica visando a investigação em larga escala de proteínas das EVs isoladas através das diferentes abordagens. Nossos resultados demonstraram que a SEC separa EVs de lipoproteínas de alta densidade (HDL), mas não de LDLs ou VLDLs, que permaneceram contaminantes. O G-UC, por sua vez, foi eficiente na separação de lipoproteínas da fração plasmática, permitindo o isolamento subsequente de EVs depletadas da contaminação por lipoproteínas. Análise proteômica, quantificação de colesterol e detecção de apo B-100 confirmaram a eliminação da contaminação por LDL e VLDL das EVs isoladas através da SEC após G-UC. Além disso, aanálise proteômica identificou números de proteínas e vias biológicas semelhantes em EVs isoladas, independentemente da depleção de lipoproteínas, o que foi consistente com as fontes celulares semelhantes identificadas por citometria de fluxo. Conjuntamente, nossos resultados demonstram que a combinação de G-UC seguida de SEC pode fornecer EVs livres de lipoproteínas sem viés de origem e função celular, permitindo a obtenção de EVs de alta pureza com potenciais implicações para ensaios funcionais e análises lipidômicas.
Resumen : Extracellular vesicles (EVs) are small membranous vesicles shed by all cell types. EVs are able to transport several biomolecules from parental cell and transfer then to target cells in an objective way. Therefore, EVs participate in many biological processes mediating cells communication, immune response and homeostasis. Previous attempts of isolating EVs from plasma have shown contamination with metabolic and inflammatory responses. Therefore, our aim was to standardize protocols for EVs isolation avoiding lipoprotein contamination. In the first work addressed in this dissertation, we present a protocol standardized by our group for the concomitant isolation of EVs and low or very low-density lipoproteins (LDL or VLDL) from plasma through ultracentrifugation of a density- based gradient (G-UC). In the following work, we tested different methods for isolating EVs without lipoprotein contamination following lipoprotein depletion by G-UC. Firstly, plasma was applied to G-UC for lipoprotein depletion and then subjected to serial centrifugation (SC) or applied to a size exclusion column (SEC) for isolation of EVs. The analysis of EVs population was made through nanoparticle tracking analysis (NTA) and flow cytometry. The absence of lipoproteins in the isolated EVs was confirmed through quantification of cholesterol and detection of apolipoprotein B100 (apoB-100) through western blot analysis. We employed bottom-up proteomics aiming the large-scale analysis of proteins in EVs isolated through the different approaches. We showed that SEC separates EVs from high-density lipoproteins (HDL) but not from LDLs or VLDLs, which remained contaminants. G-UC was efficient in separating lipoproteins from the EVs-enriched plasma fraction, allowing subsequent isolation of EVs depleted from lipoprotein contamination. Combined analysis from EVs proteomics, cholesterol quantification and apo B-100 detection confirmed the elimination of LDL and VLDL contamination by G-UC before EVs isolation. Proteomic analysis identified similar protein numbers and similar biological pathways in isolated EVs regardless of lipoprotein depletion, which was consistent with similar cellular source identified by flow cytometry. Taken together our results demonstrate that the combination of G-UC followed by SEC can provide lipoprotein-free EVs without bias of cellular origin and function, allowing the obtention of high pure EVs with potential implications for functional assays and lipidomic analysis.
Palabras clave : Vesículas extracelulares
Isolamento
Contaminação por lipoproteínas
Gradiente de densidade
SEC
Proteômica
Extracellular vesicles
Isolation
Contamination by lipoproteins
Density gradient
Proteomics
CNPq: CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS
Idioma: por
País: Brasil
Editorial : Universidade Federal de Juiz de Fora (UFJF)
Sigla de la Instituición: UFJF
Departamento: ICB – Instituto de Ciências Biológicas
Programa: Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas: Imunologia e Doenças Infecto-Parasitárias/Genética e Biotecnologia
Clase de Acesso: Acesso Embargado
Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Brazil
Licenças Creative Commons: http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/br/
DOI: https://doi.org/10.34019/ufjf/di/2022/00223
URI : https://repositorio.ufjf.br/jspui/handle/ufjf/14572
Fecha de publicación : 6-sep-2022
Aparece en las colecciones: Mestrado em Ciências Biológicas - Imunologia e Doenças Infecto - Parasitárias/Genética e Biotecnologia (Dissertações)



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