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Type: Dissertação
Title: Atividade antifúngica in vitro e in vivo do extrato metanólico de mitracarpus frigidus na sua forma livre e incorporado a uma formulação a base de quitosana
Author: Campos, Lara Melo
First Advisor: Faria Pinto, Priscila de
Co-Advisor: Fabri, Rodrigo Luiz
Referee Member: Tavares, Guilherme Diniz
Referee Member: Araújo, Marcelo Gonzaga de Freitas
Resumo: O surgimento de microrganismos multirresistentes pode ser atribuído ao uso indiscriminado de antimicrobianos para o controle de doenças, o que vem causando intensa pressão seletiva sobre os microrganismos. Responsáveis por grande parte das infecções, podemos destacar Candida albicans, um agente patogênico oportunista, associado a algumas infecções clínicas importantes, tais como candidíase vulvovaginal (CVV). Pesquisas recentes vêm investindo em novas formulações, várias destas de origem natural. A espécie Mitracarpus frigidus (Willd. ex Reem Schult.) K. Schum (MFM) apresenta atividades biológicas já relatadas, com destaque para a atividade antimicrobiana. Diante do exposto, este trabalho busca avaliar a atividade antifúngica in vitro e in vivo de MFM na sua forma live e incorporada a um gel de quitosana, frente à C. albicans (ATCC® 10231) resistente fluconazol, itraconazol, voriconazol e anidulafungina. Os ensaios in vitro foram realizados apenas com MFM livre, em duas etapas. Primeiro em células planctônicas, utilizando métodos de concentração inibitória mínima (CIM), concentração fungicida mínima (CFM), curva de crescimento, densidade celular e estudo em envoltório celular (permeabilidade com cristal violeta, extravasamento de membrana, proteção do sorbitol, ensaio de ligação do ergosterol exógeno, hidrofobicidade, dosagem de ergosterol e viabilidade). Posteriomente foram realizados ensaios em biofilme, por meio da análise de proliferação e adesão, "Whole Slide Imaging" (WSI), microscopia eletrônica de varredura (MEV) e análise do teor de carboidratos. Os ensaios in vivo compreenderam modelos experimentais de CVV, testando além de MFM livre, a sua forma incorporado a um gel de quitosana. A avaliação de CIM e CFM determinou um valor de 500 μg/mL e efeito fungistático para C. albicans, respectivamente. O ensaio da curva de crescimento resultou em uma inibição do crescimento fúngico frente à MFM. Para a densidade celular, MFM provou uma redução de 70% do número de células fúngicas. A capacidade de captação de cristal violeta foi aumentada. O ensaio de extravasamento de membrana demonstrou que MFM aumentou consideravelmente a liberação de nucleotídeos. Para a análise do sorbitol e ergosterol obteve-se um valor de CIM 4000 μg/mL e CIM 8000 μg/mL, respectivamente, o que indica uma atuação em parede e membrana celular da levedura. Os ensaios de conteúdos lipídicos indicaram uma maior liberação desses componentes nas amostras testadas. A viabilidade celular indicou uma diminuição da carga fúngica e a redução da presença de hifas, alterando o fator de virulência das amostras tratadas com MFM. Em relação aos ensaios em biofilme, MFM foi capaz de de reduzir o biofilme pré-estabelecido e interferir na sua adesão. A utilização de WSI e MEV sugeriram a redução dos biofilmes formados. A análise de carboidratos indicou também a diminuição desta estrutura e da sua matriz exopolissacarídea. Os ensaios in vivo demonstraram que MFM em suas duas formas analisadas foram capazes de reduzir a carga fúngica e o processo inflamatório. Os resultados encontrados ressaltaram ainda mais o potencial científico e terapêutico dessa planta, abrindo novas pespectivas para o tratamento de doenças infecciosas e possivelmente uma nova formulação a base de quitosana com capacidade de aplicações dermatólogicas, proporcionando sua utilização futura para tratamento da CVV.
Abstract: The emergence of multiresistant microorganisms can be attributed to the indiscriminate use of antimicrobials for disease control, which has been causing intense selective pressure on microorganisms. Responsible for most infections, we can highlight Candida albicans, an opportunistic pathogenic agent, associated with some important clinical infections, such as vulvovaginal candidiasis (CVV). Recent research has been investing in new formulations, several of these of natural origin. The species Mitracarpus frigidus (Willd. Ex Reem Schult.) K. Schum (MFM) presents biological activities already reported, with emphasis on antimicrobial activities. This work aims to evaluate the in vitro and in vivo antifungal activities of MFM in its live and incorporated into a chitosan gel against C. albicans (ATCC® 10231) resistant fluconazole, itraconazole, voriconazole and anidulafungin. In vitro assays were performed only with free MFM. For this, planktonic cell activity was analyzed using minimum inhibitory concentration (MIC), minimum fungicidal concentration (CFM), growth curve, cell density and action mechanism (permeability with violet crystal, membrane extravasation, sorbitol protection, exogenous ergosterol binding assay, hydrophobicity, ergosterol dosage and viability). Subsequently, biofilm assays were carried out by proliferation and adhesion analysis, Whole Slide Imaging (WSI), Scanning Electron Microscopy (SEM) and carbohydrate content analysis. The in vivo assays comprised experimental models of CVV, testing in addition to free MFM, its form incorporated into a chitosan gel. The evaluation of MIC and MFC determined a value of 500 μg/mL and fungistatic effect for C. albicans, respectively. Growth curve assay resulted in an inhibition of fungal growth against MFM. For cell density, MFM proved a 70% reduction in the number of fungal cells. Capability of violet crystal was increased. The membrane extravasation assay demonstrated that MFM significantly increased the release of nucleotides. For the analysis of sorbitol and ergosterol, a value of MIC 4000 μg/mL and MIC 8000 μg/mL, respectively, was obtained, indicating an action on the wall and cell membrane of the yeast. Lipid content assays indicated a greater release of these components in the samples tested. Cell viability indicated a decrease in fungal load and a reduction in the presence of hyphae, altering the virulence factor of samples treated with MFM. In relation to biofilm assays, MFM was able to reduce pre-established biofilm and interfere with its adhesion. The use of WSI and SEM suggested the reduction of formed biofilms. Carbohydrates analysis also indicated a decrease of this structure and its exopolysaccharide matrix. In vivo assays demonstrated that MFM in its two analyzed forms were able to reduce fungal load and inflammatory process. The results obtained further highlighted the scientific and therapeutic potential of this plant, opening new perspectives for the treatment of infectious diseases and possibly a new formulation based on chitosan with the capacity of dermatological applications, providing its future use for CVV treatment.
Keywords: Candida albicans
Candidíase vulvovagianal
Mitracarpus frigidus
Quitosana
Atividade antifúngica
Candida albicans
Vulvovaginal candidiasis
Mitracarpus frigidus
Chitosan
Antifungal activity
CNPq: CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS
Language: por
Country: Brasil
Publisher: Universidade Federal de Juiz de Fora (UFJF)
Institution Initials: UFJF
Department: ICB – Instituto de Ciências Biológicas
Program: Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas: Imunologia e Doenças Infecto-Parasitárias/Genética e Biotecnologia
Access Type: Acesso Aberto
Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Brazil
Creative Commons License: http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/br/
URI: https://repositorio.ufjf.br/jspui/handle/ufjf/11675
Issue Date: 20-Feb-2020
Appears in Collections:Mestrado em Ciências Biológicas - Imunologia e Doenças Infecto - Parasitárias/Genética e Biotecnologia (Dissertações)



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