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Clase: Dissertação
Título : Identificação de um domínio conservado e antigênico de ATP difosfohidrolases de parasitos, também presente em uma isoforma ativa de Leishmania (Leishmania) chagasi
Autor(es): Maia, Ana Carolina Ribeiro Gomes
Orientador: Vasconcelos, Eveline Gomes
Miembros Examinadores: Santos, Emília Maricato Pedro dos
Miembros Examinadores: Scopel, Kézia Katiani Gorza
Miembros Examinadores: Araújo, Manoel Carlos Couto de
Miembros Examinadores: Faria-Pinto, Priscila de
Resumo: Através do alinhamento de sequências de aminoácidos, análise filogenética e predição de peptídeos, nós demonstramos uma relação evolucionária e estreita relação estrutural entre um domínio particular da apirase de batata e várias proteínas de organismos patogênicos, todos eles pertencentes à família das ATP difosfohidrolases. Um fragmento recombinante baseado neste domínio (rDomB) foi obtido como uma proteína fusionada a hexahistidina. Por ELISA, significativa soropositividade de IgG para o rDomB foi observada em amostras de soros de pacientes (n=30) com esquistossomose (37%) ou leishmaniose tegumentar (40%), mas não para pacientes com doença de Chagas (20%). Adicionalmente, o inóculo de camundongos Balb/c (n=9) com rDomB induziu significativa atividade estimulatória, elevando a quantidade de anticorpos IgG, e as subclasses IgG1 e IgG2a, como observado por ELISA, sugerindo que o rDomB tem epitopos distintos capazes de induzir respostas imune dos tipos Th1 e Th2. Portanto, um domínio específico é sugerido ser potencialmente envolvido na resposta imune, e também parece ter sido conservado durante a co-evolução de hospedeiros e parasitos. Uma proteína predita identificada como NDPase, homóloga à apirase de batata, foi encontrada no genoma de Leishmania infantum (sin. L. (L.) chagasi), o agente causador da leishmaniose visceral canina. Uma atividade ATP difosfohidrolásica foi então caracterizada em preparações de promastigotas de Leishmania (L.) chagasi (MHOM/BR/1972/BH46 strain). A hidrólise de nucleosídeos di- ou trifosfatados sob a ativação de íons bivalentes, não afetada significativamente por outras fosfohidrolases, associadas à inibição promovida pela azida sódica, sugeriram fortemente uma atividade ATP difosfohidrolásica. “Western blots” desenvolvidos com anticorpos policlonais de coelho anti-apirase de batata ou anticorpos policlonais de camundongo anti-rDomB reconheceram a mesma banda de aproximadamente 50 kDa. Anticorpos anti-apirase de batata ou anti-rDomB imobilizados em Proteína A-Sepharose depletaram em torno de 86% e 41%, respectivamente, de ambas as atividades ATPásica e ADPásica de uma preparação de promastigotas solubilizada em C12E9. Os complexos resina-anticorpo de coelho-antígeno e resina-anticorpo de camundongo-antígeno foram separados por SDS-PAGE, e “Western blots” desenvolvidos, respectivamente, com anticorpos policlonais de camundongo anti-rDomB ou anticorpos policlonais de coelho anti-apirase de batata identificaram a mesma banda de 50 kDa. Por “Western blots” e ELISA, usando apirase de batata como antígeno, reatividade significativa de anticorpos IgG foi observada em soros de cães com leishmaniose visceral (INF; n= 38), domiciliados em área endêmica, sugerindo que aqueles epitopos compartilhados são antigênicos. A soropositividade de IgG do grupo INF (38%) para o rDomB foi elevada, e significativamente (P<0,001) maior que aquela encontrada em cães saudáveis também domiciliados em área endêmica (n=18; 12%). A soropositividade de anticorpos IgG para o rDomB foi significativamente maior em grupo de cães clinicamente classificados como sintomático (n=15; 67%) quando comparado aos grupo de assintomáticos (n=11; 18%) ou oligosintomáticos (n=12, 18%). Análise individual revelou variável reatividade de anticorpos IgG1 e IgG2 para rDomB, sugerindo que diferentes epitopos poderiam estar envolvidos na susceptibilidade ou resistência a leishmaniose visceral canina. Concluindo, nossos resultados confirmaram que uma isoforma de ATP difosfohidrolase ativa é expressa em promastigotas de L. (L.) chagasi, e que ela tem um domínio conservado e antigênico compartilhado com a apirase de batata. Além disso, nós indicamos o rDomB como uma nova biomolécula a ser testada em protocolos de estudos da leishmaniose visceral canina.
Resumen : By alignment of amino acid sequences, phylogenetic analysis and peptides prediction, we demonstrated evolutionary and closer structural relationships between a particular domain from the potato apyrase and several proteins from pathogenic organisms, all of them belonging to the ATP diphosphohydrolase family. A recombinant fragment based on this domain (rDomB) was obtained as a 6xHis fusion protein. By ELISA, significant IgG seropositivity for rDomB was observed in serum samples from patients (n=30) with schistosomiasis (37%) or tegumental leishmaniasis (40%), but not from Chagas disease patients (20%). In addition, inoculation of healthy Balb/c mice (n=9) with rDomB induced significant immunostimulatory ac¬tivity, increasing the amount of IgG antibody, and IgG1 and IgG2a subtypes, as observed by ELISA, suggesting that the rDomB has distinct epitopes capable of inducing Th1 and Th2-type immune responses. Therefore, a specific domain is suggested to be potentially involved in the immune response, and it also seems to be conserved during host and parasites co-evolution. A putative protein identified as NDPase, homologous to the potato apyrase, was found in the genome of Leishmania infantum (sin. L. (L.) chagasi), the causative agent of canine visceral leishmaniasis. An ATP diphosphohydrolase activity was then characterized in Leishmania (L.) chagasi promastigotes (MHOM/BR/1972/BH46 strain) preparations. The hydrolysis of di- or triphosphate nucleosides upon bivalent metal ion activation, non-significantly affected by other phosphohydrolases, associated to the inhibition promoted by sodium azide, suggested strongly an ATP diphosphohydrolase activity. Western blots developed with both rabbit polyclonal anti-potato apyrase antibodies or mouse polyclonal anti-rDomB recognized the same band of approximately 50 kDa. Anti-potato apyrase or anti-rDomB antibodies immobilized on Protein A-Sepharose depleted about 86% and 41%, respectively, for both ATPase and ADPase activities from a C12E9-solubilized promastigotes preparation. Both immunoprecipitated resin-rabbit antibody-antigen and resin-mouse antibody-antigen complexes were separated by SDS-PAGE, and Western blots developed respectively with mouse polyclonal anti-rDomB or rabbit polyclonal anti-potato apyrase antibodies identify the same 50 kDa band. In addition, anti-rDomB antibodies inhibited about 44% of the ATPase and ADPase activities from this preparation. By Western blots and ELISA, using potato apyrase as antigen, significant IgG antibody reactivity was observed in sera from dogs with visceral leishmaniasis (INF; n=38) domiciled in endemic area, suggesting that those shared epitopes are antigenic. The IgG antibody seropositivity from INF group (38%) for rDomB was elevated, and significantly (P<0.001) higher than that found in healthy dogs also domiciled in endemic area (n=18; 12%). The IgG antibody seropositivity for rDomB was significantly higher in dogs groups clinically classified as symptomatic (n=15; 67%) when compared to the asymptomatic (n=11; 18%) or oligosymptomatic (n=12; 18%) group. Individual analysis revealed variable IgG1 and IgG2 antibody reactivity for rDomB, suggesting that different antigenic epitopes could be involved in susceptibility or resistance to canine visceral leishmaniasis. In conclusion, our results confirmed that an active ATP diphosphohydrolase isoform is expressed in L. (L.) chagasi promastigote, and it has a conserved and antigenic domain shared with potato apyrase. Furthermore, we indicate the rDomB as a new biomolecule to be tested in protocols of studies of the canine visceral leishmaniasis.
Palabras clave : L. infantum
Apirase de batata
Filogenia
Conservação
Domínio
Peptídeo
Anticorpo
Humano
Cão
Camundongo
Leishmaniose visceral canina
L. infantum
Potato apyrase
Phylogeny
Conservation
Domain
Peptides
Antibody
Human
Dog
Mouse
Canine visceral leishmaniasis
CNPq: CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::GENETICA
Idioma: por
País: Brasil
Editorial : Universidade Federal de Juiz de Fora (UFJF)
Sigla de la Instituición: UFJF
Departamento: ICB – Instituto de Ciências Biológicas
Programa: Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas: Imunologia e Doenças Infecto-Parasitárias/Genética e Biotecnologia
Clase de Acesso: Acesso Embargado
Licenças Creative Commons: http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/br/
URI : https://repositorio.ufjf.br/jspui/handle/ufjf/10942
Fecha de publicación : 1-oct-2010
Aparece en las colecciones: Mestrado em Ciências Biológicas - Imunologia e Doenças Infecto - Parasitárias/Genética e Biotecnologia (Dissertações)



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