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Type: Dissertação
Title: Localização ultraestrutural da Nucleosídeo Trifosfato Dfosfohidrolase 1 (NTPDase 1) antigênica de Leishmania (Viannia) braziliensis
Author: Porcino, Gabriane Nascimento
First Advisor: Vasconcelos, Eveline Gomes
Referee Member: Santos, Emília Maricato Pedro dos
Referee Member: Faria-Pinto, Priscila de
Resumo: Uma atividade NTPDásica foi previamente caracterizada em formas promastigotas de L. (V.) braziliensis (Lb). Neste trabalho, sua localização ultraestrutural foi obtida por técnicas de citoquímica, usando um microscópio eletrônico JEM-1011. A atividade enzimática foi encontrada distribuída como um depósito de fosfato de cério eletrodenso na superfície da membrana plasmática, membrana mitocondrial, cinetoplasto, bolsa flagelar e flagelo de Lb, quando foram incubados em meio de reação padrão com ATP, ADP ou GDP, e na presença de inibidores clássicos de ATPases, fosfatase e nucleotidase. Um polipeptídio originado do domínio B conservado da apirase de batata, homólogo ao domínio B da isoforma NTPDase 1 de Lb, foi então obtido como um polipeptídio com cauda de hexahistidina (r-potDomínio B), o qual foi inoculado em camundongos BALB/c. Anticorpos policlonais anti-r-potDomínio B, quando imobilizados em Proteína A-Sepharose, imunoprecipitaram 43-46% das atividades ATPásica e ADPásica de preparação de Lb. Por ―Western blots‖, o soro imune reconheceu banda de 48 kDa na preparação de Lb e no complexo imunoprecipitado, confirmando a identidade da isoforma NTPDase 1. Amostras de soros de pacientes com leishmaniose cutânea (ACL) foram testados em ELISA, usando r-potDomínio B como antígeno. A reatividade de anticorpos IgG1 (0,077 0,059) ou IgG3 (0,020 0,024) de pacientes com ACL foi significativamente (P < 0,05) maior quando comparado ao controle (IgG1, 0,047 0,029, ponto de corte, 0,105; IgG3, 0,010 0.009, ponto de corte, 0,029), e 9-10 (30-33%) dos 30 pacientes foram soropositivos para r-potDomínio B. A reatividade de anticorpos IgG2 (0,054 0,064; 17% de soropositividade, 5/30) ou IgG4 (0,077 0,031; 23% de soropositividade, 7/30) de pacientes com ACL foi similar ao controle (IgG2, 0,050 0,021, ponto de corte, 0,092; IgG4, 0,059 0,023, ponto de corte, 0,105). Estes resultados sugeriram que o domínio B (r82-121) da NTPDase 1 de L. (V.) braziliensis está potencialmente envolvido na resposta imune do hospedeiro. Em estudo ultraestrutural e imunocitoquímico, os anticorpos policlonais anti-r-potDomínio B identificaram a isoforma NTPDase 1 na superfície do parasito e, também, na membrana mitocondrial, cinetoplasto, bolsa flagelar e flagelo. Estes resultados sugeriram que a atividade fosfohidrolítica da NTPDase 1 do parasito está possivelmente associada à recuperação de nutrientes e/ou a mecanismo protetor contra o organismo hospedeiro sob condições que envolvam nucleotídeos. Adicionalmente, anticorpos policlonais anti-r-potDomínio B (A) inibiram 22-72% das atividades ATPásica e ADPásica da preparação total de Lb; e (B) após inativação do sistema complemento, e usados em ensaios de proliferação celular pelo método MTT, inibiram significativamente 42% do aumento de promastigotas após 24 h de incubação, quando comparado à cultura na ausência de soro, ou na presença de soro de camundongo ou coelho saudável. Estes resultados sugerem que o domínio B (r82-121) da NTPDase 1 de L. (V.) braziliensis é um novo alvo terapêutico. O polipeptídio recombinante r-potDomínio B e anticorpos produzidos contra ele poderão ser úteis em estudos desta proteína do parasito e da leishmaniose cutânea.
Abstract: An NTPDase activity was previously characterized in L. (V.) braziliensis promastigote forms (Lb). In this work, its localization ultrastructural was obtained by cytochemical techniques, using a JEM-1011 electron microscope. Enzyme activity was found distributed as an electron dense cerium phosphate deposit at the surface of the plasma membrane, at mitochondrial membrane, kinetoplast, flagellar pocket and flagellum of Lb when they were incubated in standard reaction medium with ATP, ADP or GDP, and in the presence of classical ATPase, phosphatase and nucleotidase inhibitors. A polypeptide belonging to the conserved domain B from the potato apyrase, homologue to the domain B from the Lb NTPDase 1 isoform, was then obtained as a 6xHis tag polypeptide (r-potDomain B), which was inoculated in BALB/c mice. Polyclonal anti-r-potDomínio B antibodies, when immobilized on Protein A-Sepharose, immunoprecipitated 43-46% of the ATPase and ADPase activities from the parasite preparation. By Western blots, the immune serum recognized band of 48 kDa in both parasite preparations and immunoprecipitated complex, confirming the NTPDase 1 identity. Serum samples of American cutaneous leishmaniasis (ACL) patients were tested in ELISA using r-potDomain B as coating antigen. The IgG1 (0.077 0.059) or IgG3 (0.020 0.024) antibody reactivity of ACL patients was significantly (P < 0.05) higher when compared to the control (IgG1, 0.047 0.029, cut-off, 0.105; IgG3, 0.010 0.009, cut-off, 0.029), and 9-10 (30-33%) of the 30 patients were seropositive for r-potDomain B. The IgG2 (0.054 0.064; 17% seropositivity, 5/30) or IgG4 (0.077 0.031; 23% seropositivity, 7/30) antibody reactivity of ACL patients was similar to the control (IgG2, 0.050 0.021, cut-off, 0.092; IgG4, 0.059 0.023, cut-off, 0.105). These results suggested that the domain B (r82-121) from the L. (V.) braziliensis NTPDase 1 is potentially involved in the host immune response. In ultrastructural and immunocytochemical study, polyclonal anti-r-potDomain B antibodies identified the NTPDase 1 isoform on the parasite surface and, also, at mitochondrial membrane, kinetoplast, flagellar pocket and flagellum. These results suggested that phosphohydrolytic activity from the parasite NTPDase 1 is possibly associated with nutrient recuperation and/or as a protective mechanism against the host organism under conditions that involve nucleotides. Additionally, polyclonal anti-r-potDomain B antibodies (A) inhibited 22-72% of the ATPase and ADPase activities from the total Lb preparation, and (B) after complement system inactivation, and used in MTT cell proliferation assays, significantly inhibited 42% of the promastigote growth after 24 h of incubation, when compared to the cell growth in medium alone, or in the presence of serum from healthy mouse or rabbit. The domain B (r82-121) from the L. (V.) braziliensis NTPDase 1 is a new therapeutic target. The recombinant r-potDomain B polypeptide and antibodies produced against it could be useful in studies of this parasite protein and American cutaneous leishmaniasis.
Keywords: Leishmaniose tegumentar
ATP difosfohidrolase
Apirase de batata
Polipeptídeo recombinante
Anticorpo
Humano
Camundongo
Ultraestrutura
Cutaneous leishmaniasis
ATP diphosphohydrolase
Potato apyrase
Recombinant polypeptide
Antibody
Human
Mouse
Ultrastructure
Cytochemistry
Immunocytochemistry
CNPq: CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::IMUNOLOGIA
Language: por
Country: Brasil
Publisher: Universidade Federal de Juiz de Fora (UFJF)
Institution Initials: UFJF
Department: ICB – Instituto de Ciências Biológicas
Program: Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas: Imunologia e Doenças Infecto-Parasitárias/Genética e Biotecnologia
Access Type: Acesso Embargado
Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Brazil
Creative Commons License: http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/br/
URI: https://repositorio.ufjf.br/jspui/handle/ufjf/10883
Issue Date: 16-Feb-2012
Appears in Collections:Mestrado em Ciências Biológicas - Imunologia e Doenças Infecto - Parasitárias/Genética e Biotecnologia (Dissertações)



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