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Type: Tese
Title: Identificação de proteínas e validação de genes envolvidos na resistência de Brassica oleracea a Xanthomonas campestris pv. campestris
Author: Santos, Cristiane dos
First Advisor: Franco, Octávio Luiz
Co-Advisor: Reis, Angela Mehta dos
Referee Member: Santos, Marcelo de Oliveira
Referee Member: Goliatt, Priscila Vanessa Zabala Capriles
Referee Member: Ramada, Marcelo Henrique Soller
Referee Member: Pereira, Jorge Fernando
Resumo: A determinação da função gênica, visando a confirmação do envolvimento de genes em determinada condição biológica, ainda é um desafio da era pós-genômica, sendo que a análise proteômica se mostra uma técnica poderosa para essa finalidade. O enriquecimento de organelas também pode contribuir para a identificação de proteínas menos abundantes na análise de amostras complexas de plantas. No presente estudo, folhas jovens de Brassica oleracea var. capitata (repolho) de cultivares moderadamente resistente (Astrus Plus) e suscetível (Veloce) foram infiltradas com suspensão de Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc), (solução NaCl 0,85% e Xcc, OD600=0,6) e coletadas 24 h após a infecção. Para a condição controle, folhas de ambas as cultivares foram infiltradas com solução de NaCl 0,85%. As proteínas foram extraídas, do extrato de folhas e cloroplastos, com fenol e precipitadas em acetato de amônio em metanol. As amostras foram analisadas por LC-MS/MS e os espectros gerados foram analisados com os softwares Progenesis QI e PEAKS7® para identificação e quantificação de proteínas. Após a comparação da cultivar resistente inoculada com a não inoculada (RI:RC) foram identificadas 2680 proteínas, enquanto 2686 proteínas foram encontradas na comparação entre a cultivar suscetível inoculada comparada ao controle (SI:SC). Mais de 300 proteínas diferencialmente abundantes, em ambas as cultivares, foram identificadas. Do total geral, o enriquecimento de cloroplasto contribuiu com mais 600 proteínas em RI:RC e mais de 900 em SI:SC, que não foram detectadas nas amostras do extrato de folha. Foram analisados ainda 30 genes por RTq-PCR em ambas as cultivares. Na cultivar resistente, 9 genes tiveram nível de expressão diferencial estatisticamente significante em relação ao controle (7 com expressão aumentada e 2 diminuída) na cultivar resistente, enquanto a cultivar suscetível mostrou 13 genes validados (10 regulados positivamente e 3 negativamente). Entre os genes diferencialmente expressos, com significância estatística, avaliados por RTq-PCR, três genes, potencialmente envolvidos na defesa da planta, foram escolhidos para validação funcional por superexpressão gênica em planta modelo. Os genes de repolho, BoCHB4, BoESP e BoRGP1, expressos em Arabidopsis, foram validados demonstrando expressão aumentada nas plantas transgênicas (578, 22.000 e 7,5 vezes, respectivamente) quando comparado com as plantas não transformadas (wild type-WT). Este trabalho, além de contribuir para o enriquecimento do banco de dados e identificação de proteínas de adaptação ao estresse pela planta, pode fornecer informações de genes candidatos para programas de melhoramento genético.
Abstract: Gene function determination, among at the confirmation of genes involvement in certain biological condition, is still a post-genomic era challenge, being that the proteomic analysis is a powerful technique for this purpose. Cellular organelles enrichment can also contribute for the less abundant proteins identification in the complex plant samples analysis. In the present study, young leaves of Brassica oleracea var. capitata (cabbage) of moderately resistant (Astrus Plus) and susceptible (Veloce) cultivars ware infiltrated with Xanthomonas campestris pv. campestris, (NaCl 0.85% and Xcc OD600 = 0.6 solution) and collected 24 h after infection. For the control condition, the both cultivars leaves were infiltrated with NaCl 0.85% solution. Proteins from leaf extract samples and chloroplasts were extracted with phenol and precipitated with ammonium acetate in methanol. The samples were analyzed by LC-MS/MS and the generated spectra were submitted to software’s Progenesis QI and PEAKS7® for protein identification and quantification. After the comparison of the resistant inoculated cultivar with the control (RI:RC) resulted in 2680 identified proteins, while 2686 proteins were found in the susceptible inoculated cultivar compared to the control (SI:SC). More than 300 differentially abundant proteins, in both cultivars, were identified. The chloroplast enrichment contributed with more than 600 proteins in RI:RC and more than 900 in SI:SC, not identified in leaf extract samples. We further analyzed 30 genes by RTq-PCR in both cultivars. In resistant cultivar, 9 genes had differential expression level statistically significant when compared with control (7 up-regulated and 2 down-regulates), while the susceptible cultivar showed 11 validated genes (10 up-regulated and 3 downregulated). Among the differentially expressed genes, with statistical significance, evaluated by RTq-PCR, three genes, potentially involved in plant defense were choose for functional validation by genic overexpression in model plant. The genes, BoCHB4, BoESP e BoRGP1, expressed in Arabidopsis, were validated and showed up-expression in transgenic plants in RTq-PCR analysis (578, 22,000 and 7.5-fold, respectively), when compared with non-transformed plants (wild type, WT). This work besides of to contribute for protein database enrichment and identified proteins of stress adaptation by the plant provide information of potential genes candidates in genetic enhancement programs.
Keywords: Interação planta-patógeno
Podridão negra
Proteômica
Superexpressão gênica
Repolho
Plant-pathogen interaction
Cabbage
Proteome
Genic overexpression
Cabbage
CNPq: CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::GENETICA
Language: por
Country: Brasil
Publisher: Universidade Federal de Juiz de Fora (UFJF)
Institution Initials: UFJF
Department: ICB – Instituto de Ciências Biológicas
Program: Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas: Imunologia e Doenças Infecto-Parasitárias/Genética e Biotecnologia
Access Type: Acesso Embargado
Attribution-NoDerivs 3.0 Brazil
Creative Commons License: http://creativecommons.org/licenses/by-nd/3.0/br/
URI: https://repositorio.ufjf.br/jspui/handle/ufjf/10231
Issue Date: 17-May-2019
Appears in Collections:Doutorado em Ciências Biológicas - Imunologia e Doenças Infecto - Parasitárias/Genética e Biotecnologia (Teses)



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