UNIVERSIDADE FEDERAL DE JUIZ DE FORA 
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS 
DEPARTAMENTO DE PARASITOLOGIA, MICROBIOLOGIA E 
IMUNOLOGIA 
 
 
 
 
 
 
Pollyanna Amaral Salvador 
 
 
 
 
 
 
 
PAPEL DA OBESIDADE INDUZIDA POR DIETA HIPERLIPÍDICA NO 
DESENVOLVIMENTO DE CARCINOMA MAMÁRIO EXPERIMENTAL 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
JUIZ DE FORA  
2014 
POLLYANNA AMARAL SALVADOR 
 
 
 
 
 
 
 
 
PAPEL DA OBESIDADE INDUZIDA POR DIETA HIPERLIPÍDICA NO 
DESENVOLVIMENTO DE CARCINOMA MAMÁRIO EXPERIMENTAL 
 
 
 
 
 
 
Dissertação de Mestrado do Curso de 
Pós-Graduação em Ciências Biológicas, 
na área de Imunologia e Doenças Infecto 
Parasitárias, para obtenção do título de 
Mestre em Ciências Biológicas, na área 
de Imunologia e Doenças Infecto 
Parasitárias. 
 
 
 
 
 
 
Orientadora: Profª Dra. Jacy Gameiro 
 
 
 
Juiz de Fora  
2014 
  
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
  
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
“Não é porque certas coisas são difíceis que nós não 
ousamos. É justamente porque não ousamos que tais 
coisas são difíceis.” 
Sêneca (filósofo romano, 4 aC – 65 dC).  
AGRADECIMENTO 
 
 
Costumo dizer que Deus sempre coloca pessoas muito boas em meu 
caminho.  
Para começar, Ele permitiu que eu viesse a esse mundo como membro de 
uma família maravilhosa. Meus pais, Paulo e Helena são exemplos de honestidade, 
garra e dedicação. Meu irmão, Paulo Henrique, sempre paciente, sereno e dono do 
abraço mais acolhedor que possa existir. Meus “primirmãos”, meus tios, meus avós, 
o nosso Melo... Companheiros de farras, de goles, de choros, de orações. Vocês 
são a base de minha vida! A vocês, meu amor incondicional! 
Com a vinda para Juiz de Fora, novos caminhos se abriram e fui mais uma 
vez presenteada. A faculdade de Biologia me rendeu irmãos de alma, com os quais 
muito aprendi aos quais muito devo. Leda Lucinda (Ledinha), Nicolli Bellotti, Patrícia 
Duarte (Paty), Thiago Pereira (Patrick), Michelle Fernandes, Maria Elena de Castro 
(Leninha)... Apoio, companheirismo, conselhos, puxões de orelha e a certeza de 
muitas risadas nestes 10 anos. 
Ao me formar, do CBR/UFJF, ousei alçar um voo ao Rio de Janeiro. E no 
INCa/MEDEX, recebi um novo presente. Posso dizer que tudo o que lá aprendi faz 
parte dos tijolos fundamentais desse projeto ora denominado dissertação. À 
professora Adriana Bonomo, agradeço pelo apoio e por ter me mostrado, pelo sim e 
pelo não, o que é ser um pesquisador. A Suelen Perobelli, agradeço por ter feito 
com que meus dias no Rio fossem um tanto quanto “mineiros”. Aos amigos 
“cariocas” devo agradecer pelos momentos felizes que vocês me proporcionaram na 
“Cidade Maravilhosa”.  
Seguindo os impulsos do coração, do Rio de Janeiro aterrissei, literalmente, 
na Imuno JF, sendo novamente presenteada. Jacy, sem pestanejar, me acolheu de 
braços abertos, me ofereceu seu ombro amigo, seu colo de mãe. A essa 
orientadora, que é como mãe, agradeço pelo carinho, pela confiança, pelo apoio e 
compreensão, pelos conselhos, pela amizade e pelos ensinamentos. Junto dela, 
recebi de presente o “Gameiro’s Group”. E o que dizer deste grupo?! Amigos?! 
Companheiros?! Não só isso. Somos uma família! E como muito bem dito pela Jacy, 
o que nos faz uma família são as peculiaridades de cada um. A irreverência e o 
companheirismo da Gabriela Menezes (Gabi); a timidez da Maria Júlia Meewes 
(Juju); a alegria da Sara Malaguti; a meiguice da Ana Gualberto (Aninha); o 
entusiasmo do Renan Carvalho; a jovialidade do Felipe Xavier; o bom humor do 
Diego Assis (Tisco) e minha imperatividade. Sinto-me muito feliz e agradecida por ter 
vocês ao meu lado, como meus companheiros.  
Muito devo também aos amigos e companheiros de trabalho da Imuno JF. 
Aos professores Gilson Costa Macedo, Ana Paula Ferreira e Henrique Teixeira, as 
meninas da Brucella, a galerinha da asma, da EAE, da tuberculose... Também a 
professora Kézia Scopel e todos os alunos da parasito. O apoio, a confiança, as 
doações e o carinho de vocês foram de extrema importância. A Leidiana e a Sirley, 
agradeço pelo comprometimento com o trabalho, pela dedicação as tarefas, por toda 
boa vontade e disposição em nos ajudar. 
Aos empecilhos impostos pela reforma no laboratório, devo a oportunidade de 
ter feito novos amigos no laboratório de Biologia Celular. As professoras Heloísa 
Bizarro, Patrícia Almeida e Rossana Melo abriram-nos as portas, nos entregaram as 
chaves de olhos fechados. Seus alunos, sempre dispostos e prestativos dispuseram 
todo o espaço e toda boa vontade para nos acolher. A vocês, minha imensa 
gratidão.  
Deus não deixaria que eu encerrasse esse ciclo sem me presentear 
novamente. E eis que, quase ao fim dele, fui abençoada com um amor e uma nova 
família. Gláucio, meu príncipe, meu amigo, meu cúmplice, agradeço por toda alegria 
que você trouxe a minha vida, por toda dedicação, todo o amor e toda paciência 
durante a finalização deste trabalho.  
Enfim, devo agradecer a Ele, nosso Pai Celestial. Sem suas bênçãos, nada 
disso seria possível. 
 
 
 
 
 
 
 
RESUMO 
 
A obesidade tornou-se um problema de saúde pública em todo o mundo. Um 
grande número de doenças, entre elas doenças cardiovasculares, diabetes tipo 2 e 
diversos tipos de cânceres, incluindo câncer de mama na pós menopausa, estão 
associadas a obesidade.  
O câncer de mama é a principal causa de mortalidade associada ao câncer em 
mulheres nos países desenvolvidos e sua incidência tem aumentado nos países em 
desenvolvimento. A maioria das mortes associadas ao câncer de mama resulta de 
uma doença metastática não controlada. Assim, torna-se importante investigar 
alterações do estilo de vida, incluindo os hábitos alimentares, capazes de diminuir o 
risco de desenvolvimento de câncer de mama e metástases. 
Neste trabalho, investigamos o potencial de desenvolvimento do carcinoma 
mamário 4T1 e metástases em camundongos submetidos a uma dieta rica em 
lipídeos. 
Camundongos BALB/c, fêmeas, com idade de 4 a 6 semanas foram alimentados 
com dieta padrão, onde 10% das kcal eram advindas de lipídeos, ou dieta rica em 
lipídeos, onde 60% das kcal eram advindas de lipídeos; durante 6 ou 16 semanas. O 
peso corporal, o consumo de ração e o perfil bioquímico foram registrados. Ao final 
deste período, receberam células tumorais da linhagem 4T1. O peso e o volume do 
tumor, bem como o desenvolvimento de metástases ósseas foram analisados. O 
perfil das citocinas pró-inflamatórias TNF-α e IL-6, assim como o de leptina, foram 
avaliados.  
Observou-se um aumento do peso corporal dos animais alimentados pela HFD, 
sem aumento do consumo de ração, a partir da segunda semana de dieta. Após 16 
semanas de dieta, os animais obesos apresentaram aumento de gordura 
perigonadal e retroperitoneal. Além disso, demonstraram menor tolerância à glicose, 
aumento dos níveis séricos de leptina e colesterol.  
Após receberem as células tumorais, a sobrevida dos animais obesos, 
alimentados durante 16 semanas, embora não significativa, foi menor. Estes animais 
também apresentaram tumores mais volumosos e mais pesados, além de aumento 
de metástases ósseas. O perfil de citocinas destes mesmos animais, depois de 
receberem o tumor, já num estágio avançado da doença, com desenvolvimento de 
tumores secundários, também foi alterado. Observou-se diminuição da expressão de 
leptina, acompanhada de diminuição de IL-6 e TNF-α.  
Nossos resultados, em conjunto, demonstram que a ingestão de uma dieta rica 
em lipídeos é capaz de induzir a obesidade em camundongos BALB/c fêmeas e 
pode favorecer a progressão do câncer de mama.  
 
Palavras-chave: Obesidade, câncer de mama, dieta hiperlipídica 
 
 
 
 
 
 
ABSTRACT 
 
Obesity has become a public health problem. A large number of diseases, 
including cardiovascular disease, type 2 diabetes and various cancers, including 
breast cancer in post-menopausal women, are associated with obesity.  
Breast cancer is the mainly cause of cancer- related deaths in women in 
developed countries and its incidence has increased throughout the developing 
countries. Most deaths associated with breast cancer results from uncontrolled 
metastatic disease. Thus, is important to investigate changes in lifestyle, including 
dietary habits that are able to decrease the risk of developing breast cancer and 
metastasis.  
In this work, we investigate the potential development of 4T1 mammary 
carcinoma and metastases in mice subjected to a high fat diet.  
BALB/c, females, aged 4-6 weeks were fed with standard diet where 10% of kcal 
from fat or high-fat diet where 60% of kcal from fat; for 6 or 16 weeks. Body weight, 
feed intake and biochemical profile were analyzed. At the end of this period, mice of 
both groups received the 4T1 lineage tumor cells. The weight and volume of tumor 
and the development of bone metastases were examined. The profile of pro-
inflammatory cytokines TNF-α and IL-6 as well as leptin was also evaluated. 
It has been observed a body weight gain of the animals fed the HFD, without 
increasing the feed intake from the second weeks of diet. After 16 weeks of diet, the 
obese animals showed increased perigonadal and retroperitoneal fat. Moreover, they 
demonstrated reduced glucose tolerance, increased leptin and cholesterol serum 
levels.  
After receiving the tumor cells, the survival of obese animals fed for 16 weeks, 
although not significant, was lower. These animals also showed tumors bulkier and 
heavier, and increase bone metastases. The cytokine profile of obese animals that 
received tumor, already at an advanced stage of the disease, with the development 
of secondary tumors, has also changed. We observed decreased expression of 
leptin, accompanied by decreased IL-6 and TNF-α. 
Our results, taken together, show that eating a high-fat diet can induce obesity in 
BALB/c mice and may promote the progression of breast cancer. 
 
Keywords: Obesity, breast cancer, high-fat diet 
 
 
 
 
 
 
 
 
LISTA DE FIGURAS E TABELAS 
 
 
Figura 01: Representação da estimativa mundial de sobrepeso e 
obesidade entre mulheres e homens. ........................................................... Pág. 13 
Figura 02: Desenho esquemático demonstrando o desenvolvimento dos 
carcinomas mamários ductal e lobular invasivos. ......................................... Pág. 20 
Figura 03: Representação esquemática do estabelecimento de 
metástases pela hipótese de auto semeadura. ............................................ Pág. 21 
Figura 04: Representação esquemática do delineamento experimental. .... Pág. 31 
Figura 05: Desenho esquemático representando a marcação de orelha 
usada para identificação dos animais. .......................................................... Pág. 32 
Figura 06: Desenho esquemático demonstrando a localização anatômica 
das glândulas mamárias e o local de injeção das células tumorais. ............ Pág. 35 
Figura 07: Desenho esquemático demonstrando a localização anatômica 
das gorduras retroperitoneais e perigonadais. ............................................. Pág. 37 
Figura 08: Animais obesos apresentam aumento do peso corporal sem 
aumentar o consumo de ração. .................................................................... Pág. 40 
Figura 09: Aumento do peso das gorduras retroperitoneal e perigonadal 
ao longo de dezesseis semanas de dieta nos animais obesos. ................... Pág. 41 
Figura 10: Diminuição da tolerância à glicose, com aumento da glicemia 
de animais obesos. ....................................................................................... Pág. 42 
Figura 11: Aumento da concentração de leptina no soro de animais 
obesos. ......................................................................................................... Pág. 42 
Figura 12: Aumento dos níveis de colesterol total nos animais alimentados 
pela HFD. ...................................................................................................... Pág. 43 
Figura 13: Níveis de triglicérides não foram alterados pela ingestão da 
HFD. .............................................................................................................. Pág. 43 
Figura 14: Animais alimentados pela HFD durante 16 semanas 
apresentam diminuição do peso corporal após a injeção do 
tumor............................................................................................................... Pág. 45 
  
Figura 15: Mortalidade de animais controles e obesos, alimentados por 6 
ou 16 semanas de dieta, após receberem as células tumorais. ................... Pág. 46 
Figura 16: Peso da gordura perigonadal dos animais alimentados por 6 ou 
16 semanas de dieta após receberem o tumor. ........................................... Pág. 47 
Figura 17: Animais obesos alimentados durante 16 semanas de dieta 
apresentam tumores de maior peso e volume. ............................................. Pág. 48 
Figura 18: Animais obesos, alimentados durante 16 semanas de dieta, 
apresentam aumento de metástases na medula óssea. .............................. Pág. 49 
Figrua 19: Animais obesos tendem a apresentar mais metástases no 
linfonodo inguinal drenante do tumor. ........................................................... Pág. 50 
Figura 20: Animais obesos apresentam maior expressão de leptina no 
meio condicionado de tecido adiposo. .......................................................... Pág. 52 
Figura 21: Expressão alterada de IL-6 em cultura de medula óssea do 
ilíaco. ............................................................................................................. Pág. 53 
Figura 22: Expressão de TNF-α no sobrenadante de cultura de medula 
óssea do ilíaco de animais acompanhados durante 6 ou 16 semanas de 
dieta. ............................................................................................................. Pág. 54 
Figura 23: Aumento dos níveis séricos de leptina pode favorecer o 
estabelecimento do tumor e o desenvolvimento de metástases. ................. Pág. 59 
Tabela 01: Componentes da ração rica em gordura (HFD). ........................ Pág. 29 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS 
 
 
Bcl-2  “B-cell lymphoma 2” – Linfoma de células B 2 
Bcl-xL “B-cell lymphoma-extra large” – Linfoma de células B grandes 
CCL2 “C-C motif chemokine 2” – Ligante de quimiocina 2 
CCL5 “C-C motif chemokine 5” – Ligante de quimiocina 5 
CCL11 “C-C motif chemokine 11” – Ligante de quimiocina 11 
CD31 “Cluster of differentiation 31” – Grupamento de diferenciação 31 
DMBA “7,12-Dimethylbenz(a)anthracene” – 7-12-dimetilbenzeno 
(a)antraceno 
DMEM “Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium” – Meio Modificado de 
Dulbecco’s 
HFD “High-fat diet” – Dieta rica em gordura 
IFN-γ “Interferon gamma” – Interferon gama 
IGF-1 “Insulin-like growth factor 1” – Fator de crescimento semelhante 
a insulina 1 
IL-1β “Interleukin - 1 beta” – Interleucina - 1 beta 
IL-2 “Interleukin - 2” – Interleucina - 2 
IL-4 “Interleukin - 4” – Interleucina - 4 
IL-5 “Interleukin - 5” – Interleucina - 5 
IL-6 “Interleukin - 6” – Interleucina - 6 
IL-8 “Interleukin - 8” – Interleucina - 8 
IL-10 “Interleukin - 10” – Interleucina - 10 
IL-12 “Interleukin - 12” – Interleucina - 12 
IL-13 “Interleukin - 13” – Interleucina - 13 
IL-17 “Interleukin – 17” – Interleucina - 17 
IMC Índice de massa corpórea 
iNOS “Inducible nitric oxide synthase” – Óxido nítrico sintase induzível 
Ki67 Produto da expressão do gene MKI67 
MAPK “Mitogen-activated protein kinase” – Proteína quinase ativada 
por mitógeno 
MCF-7 “Human breast adenocarcinoma cell line” – Linhagem celular de 
adenocarcinoma mamário humano 
MCP-1 “Monocyte chemotactic protein - 1” – proteína quimiotática de 
monócitos - 1 
MHC “Major histocompatibility complex” – Complexo maior de 
histocompatibilidade 
MMP2 “Matrix metalloproteinase - 2” – Metaloproteinase de matriz - 2 
MMP9 “Matrix metalloproteinase - 9” – Metaloproteinase de matriz - 9 
MMP11 “Matrix metalloproteinase - 11” – Metaloproteinase de matriz - 11 
NF-κB “Nuclear factor κappa B” – Fator nuclear κappa B 
NK “Natural killer cells” – Células exterminadoras naturais 
Ob-R “Receptor for leptin” – Receptor de leptina 
PAI-1 “Plasminogen activator inhibitor-1” – Inibidor do ativador de 
plasminogênio 1 
PBS “Phosphate-buffered saline” – Tampão fosfato-salino 
PI3K “Phosphatidylinositide 3-kinases” – Fosfatidilinostideo 3 - 
quinase 
RANKL “Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand” – Receptor 
ativador do fator kappa B ligante 
ROS “Reactive oxygen species” – Espécies reativas de oxigênio 
SFB Soro fetal bovino 
TGF-β “Transforming growth factor beta” – Fator transformador de 
crescimento beta 
Th1 “T helper 1” – T auxiliar 1 
Th2 “T helper 2” – T auxiliar 2 
TLR4 “Toll-like receptor 4” – Receptor do tipo Toll 4 
TNF-α “Tumor necrosis factor alpha” – Fator de necrose tumoral alpha 
VEGF “Vascular endothelial growth factor” – Fator de crescimento 
vascular endotelial  
 
 
 
 
SUMÁRIO 
 
 
1 INTRODUÇÃO..................................................................................................... 13 
1.1 O Sistema Imune na Obesidade ...................................................................... 13 
1.1.1 Modelos Experimentais de Obesidade.......................................................... 17 
1.2 O Câncer de Mama........................................................................................... 19 
1.3 Obesidade e Câncer......................................................................................... 23 
2. OBJETIVOS........................................................................................................ 27 
2.1 Objetivo Geral................................................................................................... 27 
2.2 Objetivos Específicos........................................................................................ 27 
3 MATERIAL E MÉTODOS.................................................................................... 28 
3.1 Animais............................................................................................................. 28 
3.2 Dieta e Indução do Moedelo de Obesidade...................................................... 28 
3.3 Cultura de Células da Linhagem 4T1................................................................ 29 
3.4 Delineamento Experimental.............................................................................. 30 
3.5 Eutanásias........................................................................................................ 32 
3.6 Análises Bioquímicas........................................................................................ 32 
3.6.1 Glicemia......................................................................................................... 32 
3.6.2 Colesterol e Triglicérides................................................................................ 33 
3.7 Quantificação de Leptina ................................................................................. 33 
3.8 Indução do Modelo de Câncer de Mama Ortotópico in vivo............................. 34 
3.9 Quantificação do Volume do Tumor.................................................................. 34 
3.10 Ensaio Clonogênico Metastático..................................................................... 35 
3.11 Meio Condicionado de Gordura...................................................................... 36 
3.12 Cultura de Células Estimuladas com Anti-CD3............................................... 36 
3.13 Dosagem de Citocinas.................................................................................... 37 
3.14 Análise Estatística........................................................................................... 38 
4 RESULTADOS.................................................................................................... 39 
4.1 Avaliação do Modelo de Obesidade................................................................. 39 
4.2 Influência da HFD na Sobrevida, no Crescimento Tumoral e no 
Desenvolvimento de Metástases............................................................................ 44 
4.3 Influência da HFD no Perfil de Citocinas Pró Inflamatórias.............................. 51 
5 DISCUSSÃO........................................................................................................ 55 
6 CONCLUSÃO...................................................................................................... 60 
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................................................... 61 
  
 
13 
 
1 INTRODUÇÃO 
 
 
1.1 O SISTEMA IMUNE NA OBESIDADE 
 
 
A obesidade tornou-se um problema de saúde pública em todo o mundo.  
Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS), em 2008, mais de 1,4 bilhão de 
adultos estava acima do peso. Destes mais de 200 milhões de homens e quase 300 
milhões de mulheres eram obesos. Em geral, cerca de 35% da população adulta 
mundial encontra-se em sobrepeso, enquanto 11% é considerada obesa. No Brasil, 
os dados também são alarmantes. Estudos epidemiológicos apontam que 
aproximadamente 60% das mulheres e 54% dos homens encontram-se em 
sobrepeso (Figura 01).  
 
 
Figura 01: Representação da estimativa mundial de sobrepeso e obesidade entre mulheres e 
homens. (Adaptado de WHO, 2013). 
14 
 
Em 2011, foi estimada a existência de mais de 40 milhões de crianças, menores 
de cinco anos, com excesso de peso em todo o mundo das quais, 
aproximadamente, 35 milhões vivem nos países em desenvolvimento. A obesidade 
infantil é um grave problema de saúde pública, visto que crianças em sobrepeso ou 
obesas tendem a permanecer obesas na idade adulta e são mais propensas a 
desenvolver doenças associadas à obesidade. Além disso, estudos apontam 
redução de cinco a vinte anos na expectativa de vida, de acordo com o grau de 
obesidade (FONTAINE e BAROFSKY, 2001; WHO, 2013).  
Sobrepeso e obesidade, em adultos, são comumente classificados através do 
Índice de Massa Corporal (IMC). São considerados adultos em sobrepeso aqueles 
que apresentam IMC maior ou igual a 25, enquanto que os obesos adultos devem 
apresentar IMC maior ou igual a 30 (WHO, 2013). 
Um grande número de doenças, incluindo resistência a insulina, diabetes tipo 2, 
doenças cardiovasculares e diversos tipos de câncer, tais como cânceres 
hematológicos, câncer de próstata, câncer de cólon, câncer de mama na pós-
menopausa, entre outros, está associado a obesidade. (KHANDEKAR, COHEN e 
SPIEGELMAN, 2011). 
Um acúmulo de adipócitos, correlacionado a um elevado IMC caracterizam, 
biologicamente, a obesidade. Trata-se de uma síndrome metabólica multifatorial, 
com interação entre hormônios, neuropeptídios e citocinas, acarretando 
consequências ao eixo neuro-imuno-endrócrino (DIXIT, 2008). 
Muitos estudos relacionando a interação de hormônios, células, neuropeptídios e 
citocinas à fisiologia dos sistemas neuroendócrino e imunológico, bem como a 
resposta imunológica, têm sido realizados (CHROUSOS, 1995; CORREIA-DE-
SANTANA et al., 2009; DARDENNE et al., 2009; MENDES-DA-CRUZ et al. 2009; 
PEREZ et al. 2009, SAVINO, 2010).  
A leptina é um dos principais hormônios associados à obesidade. Produzida, 
principalmente, pelo tecido adiposo, proporcionalmente a massa de gordura e, em 
níveis inferiores em tecidos como o estômago, placenta e músculo esquelético, é um 
exemplo evidente de hormônio que atua tanto no sistema neuroendócrino quanto 
imunológico (ROBERTSON et al., 2008; LEINNINGER et al.,2008).  
Foi primeiramente descrita como um regulador da saciedade e do controle de 
peso. No entanto, sabe-se que a leptina pode também afetar a homeostase do timo, 
aumentar a quimiotaxia de neutrófilos, induzir a secreção de interleucina 1 (IL-1), 
15 
 
interleucina 6 (IL-6) e do fator de necrose tumoral alpha (TNF-α, do inglês “tumor 
necrosis factor”); aumentar a expressão de moléculas de adesão, a expressão de 
moléculas do complexo maior de histocompatibilidade (MHC, do inglês “major 
histocompatibility complex”), a atividade fagocítica de macrófagos, além de aumentar 
a secreção de perforinas por células NK. Inibe respostas do tipo T “helper” β (Thβ), 
promovendo a diferenciação de células T “helper” 1 (Th1), o aumento de linfócitos T 
CD8 e macrófagos; é capaz de induzir a proliferação de linfócitos T CD4 e a 
produção de interleucina 2 (IL-2) por essas células e pode ainda modular o 
aparecimento e a progressão de respostas autoimunes em modelos animais dessas 
doenças (ZHAO et al., 2003; LA CAVA e MATARESE, 2004; BERNOITIENE et al., 
2006; LAM e LU, 2007, MATARESE et al., 2008; LIKUNI et al., 2008; CARLTON et 
al., 2012).  
Camundongos obesos, deficientes de leptina (ob/ob) ou deficientes do receptor 
de leptina (db/db), não são apenas gravemente obesos, mas apresentam também 
uma série de deficiências secundárias, como: anormalidades na reprodução, na 
hematopoiese, na angiogênese, na secreção de insulina, no metabolismo ósseo, 
lipídico e de glicose, além de importantes alterações na imunidade inata e adaptativa 
(BANNETT et al., 1996; CHEHAB, LIM e LU, 1996; LORD et al., 1998; SIERRA-
HONIGMAM et al., 1998; PARK et al., 2001; LAM e LU, 2007; SANCHEZ-MAGALET 
et al., 2009). Existem também relatos de que humanos com deficiência de leptina 
apresentam susceptibilidade a doenças infecciosas oportunistas, com menor 
proliferação de linfócitos T CD4, ausência de IFN-Ȗ (do inglês “interferon gamma”), 
menor produção de interleucina 4 (IL-4) e interleucina 10 (IL-10) e aumento da 
secreção do fator de crescimento tumoral do tipo beta (TGF-ȕ, do inglês “tumor 
growth factor”). Interessantemente, a administração exógena de leptina é capaz de 
restaurar as funções imunológicas desses indivíduos (LAM e LU, 2007). 
Diversas evidências apontam a obesidade como um estado inflamatório crônico 
de baixo grau que contribui para o desenvolvimento de desordens relacionadas à 
obesidade, em especial, à disfunção metabólica (SHOELSON, LEE e GOLDFINE, 
2006). Sabe-se que o tecido adiposo funciona também como uma glândula 
endócrina capaz de secretar diversas substâncias bioativas. Tais substâncias, 
denominadas coletivamente como adipocinas, podem alterar a composição de 
tecidos, incluindo alterações no número, no fenótipo e na localização de células 
imunes e vasculares. Indivíduos obesos comumente apresentam um aumento dos 
16 
 
níveis de citocinas pró-inflamatórias no sangue, em função do excesso de tecido 
adiposo e até mesmo de uma disfunção dos adipócitos, o que pode levar a 
respostas imunes alteradas, conduzindo a patogênese de diversas doenças. (BERG 
e SCHERER, 2005; NORIYUKI et al., 2011).  
Os mais abundantes depósitos de tecido adiposo são o visceral e o subcutâneo, 
que produzem perfis exclusivos de adipocinas, tais como TNF-α e IL-8 (SAMARAS 
et al., 2010). No entanto, acúmulos de adipócitos podem ser encontrados por todo 
corpo, associados a diversos órgãos, como coração, rins, medula óssea, pulmões e 
grandes vasos sanguíneos com evidências de indução de um estado pró-
inflamatório nessas regiões (CHATTERJEE et al., 2009).  
Muitas células do sistema imunológico estão presentes no tecido adiposo, dentre 
elas: macrófagos, linfócitos, neutrófilos e células dendríticas (SCHIPPER et al., 
2012). O tecido adiposo tanto de indivíduos obesos como nos modelos animais de 
obesidade apresenta um grande infiltrado de macrófagos e o recrutamento dessas 
células está ligado à inflamação sistêmica e a resistência à insulina, sendo os 
maiores responsáveis pela produção de citocinas pró-inflamatórias (XU et al., 2003; 
WEISBERG et al., 2003). 
Diferentes subtipos de macrófagos estão envolvidos na inflamação do tecido 
adiposo induzida pela obesidade.  Macrófagos que se acumulam no tecido adiposo 
de obesos são, principalmente, M1 ou macrófagos classicamente ativados; enquanto 
que aqueles do tecido adiposo de camundongos magros são do tipo M2 ou 
alternativamente ativados (LUMENG, BODZIN e SALTIEL, 2007). Estímulos gerados 
por citocinas do tipo Th1, incluindo IFN-Ȗ, ou por produtos bacterianos e sinalização 
via receptores do tipo Toll-Like leva a geração de macrófagos M1, capazes de 
produzir altas concentrações de citocinas pró-inflamatórias, tais como TNF-α, IL-1ȕ, 
IL-6 e IL-12; e geram radicais livres através da expressão de óxido nítrico sintase 
induzível (iNOS) e de espécies reativas de oxigênio (ROS) (CHAWLA et al., 2011). 
Em contraste, macrófagos são polarizados para o fenótipo M2 por citocinas do tipo 
Th2, como IL-4 e IL-13 (ODEGAARD et al., 2008). Funcionalmente, macrófagos M2 
estão associados com a reparação de tecidos lesados e a resolução da inflamação 
(GORDON, 2003). Desta forma, macrófagos M1 promovem a resistência à insulina e 
macrófagos M2 protegem contra a resistência à insulina induzida pela obesidade 
(ODEGAARD e CHAWLA, 2011).  
17 
 
Outras células imunológicas parecem alteradas na obesidade. Modelos 
experimentais de camundongos obesos ob/ob apresentam atrofia tímica e defeitos 
associados à resposta de linfócitos T, reduzida capacidade de apresentação de 
antígenos pelas células dendríticas e diminuída capacidade de ativar a proliferação 
de linfócitos T (LA CAVA e MATARESE, 2004; MACIA et al., 2006). Uma menor 
diversidade de células T também foi observada em modelos animais de obesidade, 
sugerindo imunovigilância prejudicada (YANG, et al., 2009). Além disso, animais 
db/db, com deficiência no receptor de leptina, apresentam um déficit de células NK, 
além de menor citotoxicidade destas células, resultante do desenvolvimento anormal 
das mesmas  nestes animais (LA CAVA e MATARESE, 2004) . O menor número de 
células NK com função citotóxica alterada também é observado em humanos 
(O’SHEA et al., 2010), demostrando que os modelos experimentais de obesidade 
apresentam características semelhantes aquelas  observadas em humanos e são 
úteis para o estudo desta patologia.  
 
 
1.1.1 MODELOS EXPERIMENTAIS DE OBESIDADE 
 
 
A indução da obesidade pode ser realizada, em animais, por alterações 
neuroendócrinas, nutricionais ou genéticas. A grande similaridade entre o genoma 
dos roedores e o dos seres humanos tornam esses modelos animais uma 
importante ferramenta para o estudo da obesidade (VON DIEMEN, TRINDADE e 
TRINDADE, 2006). 
Os principais modelos para indução de obesidade em ratos e camundongos são: 
lesões do núcleo hipotalâmico ventromedial, ovarectomia, dieta hipercalórica e 
manipulações genéticas. 
A administração de glutamato monossódico (MSG) a ratos ou camundongos 
recém-nascidos provoca a destruição dos núcleos hipotalâmicos ventromedial e 
arqueado. Nesse caso, os animais desenvolvem a obesidade devido à falta de 
controle entre a absorção e o gasto de energia (LORDEN e CAUDLE, 1986). Sabe-
se que neste modelo não há um aumento da ingestão de alimentos. Segundo 
18 
 
Djazayery (1979), a obesidade induzida quimicamente ocorre devido à diminuição da 
taxa metabólica destes animais. Lesões no núcleo hipotalâmico ventromedial 
também podem ser desenvolvidas por correntes elétricas capazes de causar a 
destruição bilateral dos núcleos hipotalâmicos, levando a obesidade. Sabe-se que a 
lesão elétrica do hipotálamo provoca aumento do nível de leptina, a redução do total 
de neuropeptídeo Y, mantendo as flutuações do ciclo circadiano e parece haver uma 
perda do “feedback” entre os mecanismos de insulina e leptina (DUBE et al., 1999). 
 A partir de observações de que mulheres na pós-menopausa apresentam 
uma série de alterações metabólicas, incluindo ganho de peso, um novo modelo de 
obesidade surgiu através da ovarectomia. É um modelo bastante útil para se estudar 
as modificações pelas quais as mulheres passam ao fim de sua idade fértil. A 
remoção das gônadas provoca uma queda nos níveis de leptina, associada a um 
período de hiperfagia e acentuado ganho de peso. Sete semanas após a 
ovarectomia, os níveis de leptina são restaurados chegando a níveis mais elevados 
que os pré-operatórios (CHU et al., 1999; AINSLIE et al., 2001; CHEN e HEIMAN, 
2001; KIMURA et al., 2002; MELI et al., 2004).  
 O modelo mais simples de indução de obesidade e, possivelmente, aquele 
que mais se assemelha a realidade da obesidade em humanos é o modelo de dietas 
hipercalóricas. Vários tipos de dietas são eficazes na indução da obesidade. 
Algumas delas atingem valores hipercalóricos pela adição de carboidratos e outras 
pela adição de gorduras (VON DIEMEN, 2006). Meguid e colaboradores, em 2004, 
induziram o modelo usando uma dieta cuja composição consistiu em 48% de ração 
convencional, 8% de óleo de milho e 44% leite condensado, sendo os animais 
alimentados durante 7 a 12 semanas. Usando dietas hipercalóricas compostas por 
17,4% de carboidratos, 42,9% de proteínas e 39,7 % de gordura ou 21% de 
carboidratos, 24% de proteínas e 55% de gordura, Prunet-Marcassus e 
colaboradores também induziram o modelo de obesidade por dieta, em 2004.  
 Em 1990, quando foram identificados cinco diferentes genes causadores da 
obesidade, os modelos genéticos começaram a ser usados. Existem mais de 50 
tipos diferentes de modelos genéticos de obesidade em roedores. No final de 1994, 
o gene da obesidade de rato foi clonado (ob/ob) e cerca de um ano depois se clonou 
o gene do diabetes (db/db). Diversos estudos mostraram que esses genes 
pertenciam a mesma via metabólica e que o db/db poderia ser um receptor do ob/ob. 
Posteriormente, o produto do gene ob/ob foi identificado e denominado como leptina. 
19 
 
Assim, os animais ob/ob desenvolvem uma síndrome que inclui hiperfagia, diabetes 
e obesidade, cuja origem se deve a ausência de leptina ou a presença não funcional 
desse hormônio. Os animais db/db apresentam uma mutação que faz com que haja 
a resistência à leptina, ou seja, eles possuem leptina, mas não um receptor funcional 
para o hormônio. Estes animais são hiperinsulinêmicos, intolerantes a glicose, 
apresentam alterações neuroendócrinas e termogênicas, além de hiperfagia e 
infertilidade (CHAGNON e BOUCHARD, 1996; ROBINSON, DINULESCO e CONE, 
2000; BROCKMANN e BEVOVA, 2002). 
Investigar as causas e os efeitos da indução de obesidade em modelos 
experimentais pode proporcionar a melhor compreensão da fisiopatologia desta 
doença e novas opções para prevenção e tratamento. No entanto, é necessário 
escolher o modelo que melhor se adapta as características a serem pesquisadas, 
sejam elas ambientais ou genéticas (VON DIEMEN, TRINDADE e TRINDADE, 
2006). 
 
 
1.2 O CÂNCER DE MAMA 
 
 
O câncer de mama é o tipo mais frequente de câncer em mulheres, 
apresentando incidência crescente e alta taxa de mortalidade. Estima-se que, nos 
Estados Unidos, esta seja a segunda principal causa de morte associada a câncer 
em mulheres e que a maioria destas mortes resulte de doença metastática não 
controlada (DISANTIS et al., 2014). É um câncer capaz de propagar-se para outras 
partes do corpo dentro de três anos do diagnóstico inicial em cerca de 10 a 15% dos 
casos (HELMAN e HARRIS, 2000). As células dos tumores sólidos, incluindo o 
carcinoma de mama, migram através do sistema linfático ou circulatório e invadem 
outros órgãos à distância por mecanismos ainda pouco definidos.  
Dentre os carcinomas mamários, o carcinoma ductal invasivo é o tipo mais 
comum de câncer de mama, perfazendo um total de 80% de todos os casos de 
câncer de mama. Nesta patologia, um câncer que se inicia nos ductos de leite é 
capaz de invadir e se espalhar pelos tecidos mamários circundantes (Fig. 02) 
20 
 
Inicialmente, é assintomático, sendo na maioria das vezes detectado por alterações 
na mamografia ou pelo aparecimento de um nódulo palpável no tecido mamário 
(breastcancer.org).  
O segundo tipo mais comum de câncer de mama é o carcinoma lobular 
invasivo, que se origina nos lóbulos produtores de leite, podendo invadir e se 
espalhar pelos tecidos adjacentes, conforme demonstrado na figura 02. Perfaz um 
total de 10% dos casos de câncer de mama e tende a ocorrer em mulheres mais 
velhas do que aquelas acometidas pelo carcinoma ductal invasivo. Os carcinomas 
lobulares invasivos tendem a ser mais difíceis de visualizar em mamografias porque 
em vez de formar um nódulo, as células cancerosas se espalham para o tecido 
conjuntivo circundante (estroma mamário) e formam estruturas em linha 
(breastcancer.org). 
 
 
 
 
 
 
A metástase, principal causa de morte em pacientes com câncer, ocorre 
quando as células tumorais deixam seus locais de origem e migram para locais 
adjacentes ou distantes.  Em 1874, foi proposto por De Morgan que as células 
tumorais progrediam de forma linear, atingindo primeiramente os linfonodos e, 
posteriormente, locais distantes (revisto por COMEN, 2012). No entanto, foi 
Figura 02: Desenho esquemático demonstrando o desenvolvimento dos carcinomas 
mamários ductal e lobular invasivos. (Adaptado de www.breastcancer.org). 
21 
 
observado que mulheres, após mastectomia total, mesmo sem comprometimento 
dos linfonodos axilares, desenvolviam doença metastática. Assim, foi postulada a 
hipótese de que as células tumorais podem se propagar por via linfática e também 
pela circulação sistêmica (SHAPIRO e FUGMANN, 1957; FISHER, 1977). Mais 
recentemente, foi proposto o modelo de auto semeadura, acreditando-se que as 
células tumorais possuem a capacidade de migrar de um local para outro, podendo 
se estabelecer em locais próximos ao tumor primário, em locais distantes, bem como 
recolonizar o sítio do tumor primário (Fig. 03). Com esta hipótese, também foi 
afirmada a ideia de que tumores pequenos podem ser altamente metastáticos, bem 
como tumores de grande volume podem apresentar uma pequena capacidade 
metastática (NORTON e MASSAGUE, 2006). Sabe-se que tumores primários podem 
ser bastante heterogêneos e, desta forma, apresentar células cancerosas com 
diferentes capacidades de disseminação. Logo, um pequeno número de células com 
capacidade metastática podem ocasionar metástases significativas (LIU et al., 
2010). Além disso, dada à heterogeneidade do tumor, os clones de células tumorais 
podem se adaptar a diferentes ambientes, em diferentes órgãos (GERLINGER et al., 
2012). Também foi demonstrado que as células cancerosas podem apresentar 
assinaturas genéticas específicas, capazes de dirigi-las, especificamente, a 
determinados órgãos (MINN et al., 2005 ).  
 
 
 
 
 
Figura 03: Representação esquemática do estabelecimento de metástases pela hipótese de auto 
semeadura. As células cancerosas deixam o tumor primário e podem circular de volta para o tumor 
primário (A) ou seguir através da circulação, como uma célula de tumoral circulante (B). As células 
tumorais circulantes podem se disseminar em locais distantes (C, D), proliferar no próprio tumor 
secundário (E), ou voltar ao sítio de tumor primário (F). (Adaptado de Comen, 2012).  
22 
 
É bem documentado que as células tumorais derivadas de carcinomas de 
mama, frequentemente, se disseminam por via hematológica e progridem 
preferencialmente no microambiente da medula óssea. A presença de células 
tumorais circulantes no sangue periférico ou disseminadas na medula óssea é de 
grande relevância clínica e representa um pior prognóstico (LIANIDOU et al., 2010). 
Estima-se que 70% das pacientes desenvolvem metástases ósseas, mesmo após a 
completa remoção do tumor primário. As células tumorais aderem à superfície 
endosteal da medula óssea e colonizam o osso, utilizando de fatores que, além de 
estimularem o crescimento tumoral, alteram seus fenótipos tornando-as resistentes 
às respostas anti-tumorais (KAKONEN e MUNDY, 2003). As terapias atuais que 
incluem cirurgia, terapia hormonal, quimioterapia, radioterapia e outras combinações 
não são completamente eficazes para o tratamento de metástases de câncer de 
mama (ALI, HARVEY e LIPTON, 2003).  
 O estabelecimento de modelos experimentais que representem fielmente os 
processos metastáticos ósseos que ocorrem in vivo é o maior desafio para o estudo 
de metástases (TAO et al., 2008). Modelos xenogênicos obtidos pela injeção de 
células tumorais humanas em camundongos imunocomprometidos são 
extensivamente utilizados para o estudo do crescimento tumoral, estabelecimento de 
metástases e validação de produtos gênicos específicos do tumor como possíveis 
alvos-terapêuticos. Entretanto, esses modelos não são capazes de estabelecer 
eficientemente esses processos e quando o fazem, são observadas diferentes 
propriedades metastáticas (BIBBY, 2004). Em contrapartida, modelos experimentais 
singênicos, que utilizam células tumorais murinas, estabelecem metástases mais 
eficientemente e apresentam características metastáticas similares àquelas 
observadas em humanos (HEPPNER, MILLER e SHEKHAR, 2000). Além disso, os 
modelos murinos singênicos permitem que toda a análise seja realizada em animais 
com funções imunológicas normais. Sabe-se que o sistema imunológico 
desempenha um papel importante no desenvolvimento e progressão de câncer e 
modelos que podem ser usados em animais imunocompetentes são essenciais para 
a análise da progressão e avaliação de terapias anti-tumorais. 
Um modelo animal clinicamente relevante para geração de metástases 
espontâneas foi estabelecido em camundongos BALB/c. A linhagem celular de 
carcinoma de mama, denominada 4T1, derivada espontaneamente de um tumor 
mamário murino, ortotopicamente introduzida em camundongos BALB/c, é altamente 
23 
 
tumorigênica e invasiva, sendo capaz de originar metástases para os mesmos 
órgãos afetados pelo câncer de mama em humanos, incluindo osso, pulmão, fígado 
e cérebro (MILLER, 1983; LELEKAKIS, 1999).  Além disso, o tumor primário pode 
ser removido cirurgicamente, e a doença metastática pode continuar a ser estudada, 
de forma semelhante à que ocorre na prática clínica com pacientes humanos. Em 
consequência da heterogeneidade desse carcinoma, várias linhagens parentais de 
4T1 foram isoladas e caracterizadas e seguem vias divergentes de aquisição de 
fenótipos metastáticos, sendo que uma delas, a 67NR, permanece no sítio primário 
(LELEKAKIS, 1999). 
Devido à alta capacidade de exibir metástases nos mesmos sítios afetados 
pelo câncer de mama humano, o modelo de carcinoma mamário murino 4T1 
representa um sistema ideal para o estudo de metástases, regimes terapêuticos, 
investigações de bases moleculares, celulares e patológicas de câncer de mama em 
diversos órgãos e tecidos.  
 
 
1.3 OBESIDADE E CÂNCER  
 
 
Estima-se que 15 a 30% das mortes causadas por câncer nos Estados 
Unidos seja atribuída ao sobrepeso e obesidade (World Cancer Research/American 
Cancer Research, 2007). 
Estudos epidemiológicos indicam que o consumo de dieta rica em gordura, 
independente do tipo de gordura, pode levar ao aumento do risco de 
desenvolvimento de câncer de mama invasivo em mulheres na pós-menopausa. 
Sabe-se também que um elevado IMC está associado ao pior prognóstico de câncer 
de mama (WHITEMAN et al., 2005; THIEBAUT et al., 2007; DAWOOD et al., 2008). 
Os mecanismos que vinculam a obesidade e desenvolvimento de câncer 
incluem resistência à insulina, hiperinsulinemia crônica, maior biodisposição de 
hormônios esteróides, inflamação local e secreção de adipocinas pelo tecido 
adiposo (CALLE, 2007).  
24 
 
Além de apresentarem níveis alterados de moléculas inflamatórias, indivíduos 
obesos apresentam também elevadas concentrações do Fator de Crescimento 
Vascular e Endotelial (VEGF, do inglês “vascular endothelial growth factor”), do 
Inibidor do Ativador de Plasminogênio -1 (PAI-1, do inglês “plasminogen activator 
inhibitor-1”) e do Fator de Crescimento Semelhante a Insulina -1 (IGF-1, do inglês 
“insulin-like growth factor 1”) que estão diretamente relacionados a expansão de 
tumores (HURSTING e BERGER, 2010). Estudos clínicos e in vitro também 
demonstraram que a leptina, presente em altas concentrações em obesos, está 
relacionada ao desenvolvimento de câncer, dentre eles, câncer de mama (GARCIA-
ROBLES, SEGURA-ORTEGA e FAFUTIS-MORIS, 2013).  
Sabe-se que o aumento dos níveis de leptina, TNF-α e insulina levam ao 
aumento da produção de IL-6 pelos adipócitos. Por sua vez, a ativação da IL-6 está 
relacionada à transcrição de proteínas sinalizadoras ligadas a proliferação, 
sobrevivência e invasão de células tumorais (LYSAGHT et al., 2011). Ao investigar o 
papel do TNF-α e da hiperinsulinemia no desenvolvimento de câncer de colo retal 
em animais obesos, demonstrou-se que esses animais possuíam um infiltrado 
inflamatório no cólon, rico em macrófagos e leucócitos, associados a danos nas 
células epiteliais. Os animais obesos também apresentaram tumores mais 
proeminentes e associou-se isso a altos níveis de TNF-α, podendo esta citocina 
estar diretamente relacionada ao crescimento de tumores de cólon em animais 
obesos (FLORES at al., 2011). 
James e colaboradores, em 2012, ao avaliar camundongos obesos induzidos 
por dieta e portadores de carcinoma de células renais em modelo ortotópico, 
observou que os animais obesos apresentaram aumento do infiltrado local de 
células T e crescimento precoce do tumor quando comparados aos animais magros.  
Além disso, a ativação e a funcionalidade das células dendríticas dos animais 
obesos foi prejudicada, sugerindo que a obesidade pode diminuir a eficácia de 
imunoterapias baseadas no uso de células dendríticas.  
Um alto percentual de tecido adiposo visceral está relacionado à menor 
concentração de testosterona e a maior agressividade de tumores de próstata. Ao 
avaliar pacientes chineses submetidos à prostatectomia total, Qu e colaboradores, 
em 2013, observaram que, embora o IMC não estivesse relacionado a um pior 
prognóstico da patologia, o percentual mais elevado de tecido adiposo visceral foi 
preditivo de um maior escore patológico do tumor de próstata, bem como de maiores 
25 
 
probabilidades de extravasamento da cápsula prostática e de invasão da vesícula 
seminal. Com isso, sugeriram que a distribuição da gordura abdominal está 
associada a um alto risco de desenvolvimento de câncer de próstata. 
A obesidade também está relacionada com o desenvolvimento de tumores de 
mama. Sabe-se que o tecido mamário adulto é composto, em grande parte, por 
adipócitos, a principal célula do tecido adiposo, e o número desses adipócitos pode 
ultrapassar o número de células epiteliais (LIN e POLLARD, 2007). Além disso, é 
bem documentado que em indivíduos obesos, ocorre diminuição da maturação de 
pré-adipócitos em adipócitos e alteração do balanço entre leptina e adiponectina 
(VONA-DAVIS e ROSE, 2009; SIMONS et al., 2010). As citocinas secretadas pelos 
pré-adipócitos atraem monócitos e altas concentrações locais de leptina promovem 
a conversão de monócitos em macrófagos, que contribuem para a produção local de 
citocinas pró-inflamatórias e fatores pró-angiogênicos (VONA-DAVIS e ROSE, 
2009). Estes mecanismos, além de bloquearem a maturação de pré-adipócitos em 
adipócitos, dão origem a um microambiente favorável ao crescimento de tumores 
(CAMPBELL et al., 2010; ZEYDA et al., 2010). 
Os altos níveis de ácidos graxos livres, observados em indivíduos obesos, 
também podem estimular a produção de citocinas pelos pré-adipócitos. Foi 
demonstrado que os ácidos graxos livres ativam a sinalização de receptores Toll-like 
4 (TLR4) e aumentam a secreção de IL-6, CCL2, CCL5 e CCL11, o que também 
prejudica a diferenciação dos pré-adipócitos (POULAIN-GODEFROY e FROGUEL, 
2007). Várias dessas citocinas, especialmente CCL2 e CCL5, suprimem a imunidade 
antitumoral mediada por células T (SORIA e BEM-BARUCH, 2008).  
Em 2011, foi demonstrado por Subbaramaih e colaboradores, usando 
modelos genéticos de obesidade e também em modelos de obesidade induzida por 
dieta, aumento das coroas de macrófagos ao redor de adipócitos na glândula 
mamária de camundongos obesos. Estes animais também apresentaram altos níveis 
de mediadores pró-inflamatórios e do fator nuclear κB (NF - κB) induzindo o aumento 
de aromatase. A indução da aromatase aumentaria a produção local de estrogênio e 
este fato favoreceria o crescimento de tumores de mama sensíveis ao estrogênio.  
Ao avaliar a influência de uma dieta hipercalórica na progressão do tumor de 
mama humano que apresenta o receptor de estrogênio (ER-positivo), Lamas e 
colaboradores, em 2013, observaram maior crescimento do tumor, um aumento da 
expressão de Ki67, acompanhado de diminuição da clivagem de caspase-3 e menor 
26 
 
expressão dos receptores de estrogênio ȕ (ER-ȕ) e de progesterona, além de menor 
citotoxicidade de células “natural killer” (NK) no baço dos animais alimentados pela 
dieta hipercalórica.  Sugeriram então que uma dieta hipercalórica, mesmo sem 
aumento do peso corporal, pode aumentar a proliferação deste tumor e reduzir a 
apoptose do mesmo.  
 Llaverias e colaboradores, em 2011, examinaram o papel do colesterol na 
regulação e na progressão de tumor mamário em um modelo de camundongo 
transgênico. Sugeriram que o colesterol acelera a formação de tumores e aumenta a 
angiogênese, dando maior agressividade a esses tumores.  
 Kim e colaboradores, em 2011, demonstraram que o consumo prolongado de 
uma dieta rica em gordura tem pouco efeito sobre o consumo energético e o peso 
corporal de camundongos BALB/c, mas leva ao aumento do crescimento do tumor e 
de metástases pulmonares, além de maior mortalidade quando esses animais 
receberam células de carcinoma mamário 4T1. Esses animais também 
apresentaram maior infiltrado de macrófagos no tecido adiposo e níveis séricos de 
leptina mais elevados.  
Sabe-se que as metaloproteinases de matriz (MMP) modulam a invasão 
tecidual das células tumorais e promovem a metástase. Todo o microambiente 
inflamatório, ocasionado pela obesidade, e a grande produção de citocinas, tais 
como IL-1, IL-5, IL-6, IL-17 nesse microambiente, favorecem a ativação de MMP-2, 
MMP-9 e MMP-11. Em conjunto, estes fatores favorecem um pior prognóstico do 
carcinoma mamário e podem promover a metástase (EIRÓ et al., 2013; SIMPSON e 
BROWN, 2013). 
 Diante destas constatações, é evidente que há uma relação íntima entre 
obesidade, alterações metabólicas e imunológicas e o desenvolvimento de tumores. 
No entanto, muitos estudos ainda são necessários para se entender essa relação. 
Assim, considerando-se o progressivo crescimento de quadros de obesidade em 
todo o mundo, as elevadas taxas de mortalidade e morbidade associadas a esta 
doença e os impactos que causa no sistema imunológico, estudos que avaliem o 
desenvolvimento de tumores e o papel do imunometabolismo nesta progressão são 
extremamente relevantes.  
27 
 
2 OBJETIVOS 
 
 
2.1 OBJETIVO GERAL 
 
 
 Avaliar o impacto da obesidade no estabelecimento do tumor de mama e 
metástases em animais que receberam a linhagem de célula tumoral 4T1.  
 
 
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 
 
 
 Avaliar o tempo de dieta mais adequado para indução de obesidade 
em camundongos BALB/c fêmeas;  Avaliar o perfil bioquímico desses camundongos ao longo das semanas 
de dieta, bem como o acúmulo de tecido adiposo nas regiões 
retroperitoneais e perigonadais, além da concentração de leptina no 
soro;  Avaliar o crescimento tumoral e metástases através de medidas de 
peso e volume do tumor e ensaios clonogênicos;  Avaliar a concentração das citocinas TNF-α e IL-6 na medula óssea do 
ilíaco dos animais dos diferentes grupos experimentais, bem como a 
concentração de leptina no meio condicionado de gordura.  
 
 
 
 
 
 
 
28 
 
3 MATERIAL E MÉTODOS 
 
 
3.1 ANIMAIS 
 
 
 Foram utilizados camundongos BALB/c, fêmeas, com idade entre 4 e 6 
semanas e peso entre 18 e 20g, obtidos da colônia do Biotério de Centro de Biologia 
da Reprodução, da Universidade Federal de Juiz de Fora.  
Os animais foram acondicionados em gaiolas de polipropileno, cobertas com 
cama de maravalha, dotadas de cocho para ração e local para mamadeira com água 
filtrada. Cada gaiola, medindo 30x20x13 cm, continha cinco animais e foi mantida 
em armários climatizados (ALESCO), localizados em alojamento com ciclo de 
fotoperíodo de 12h claro/12h escuro, controlado automaticamente, durante todo o 
procedimento experimental.  
O protocolo experimental do presente trabalho foi submetido à Comissão de 
Ética no Uso dos Animais da Universidade Federal de Juiz de Fora, recebendo 
aprovação, certificada no Protocolo de nº 039/2012 – CEUA. 
 
 
3.2 DIETA E INDUÇÃO DO MODELO DE OBESIDADE 
 
 
 Para realização destes experimentos, os animais designados como controles 
foram alimentados com a ração comercial padrão (Nuvilab), na qual 10% das 
quilocalorias (kcal) eram advindas de lipídeos, 20% de proteínas e 70% de 
carboidratos. Já os animais designados como obesos receberam uma dieta rica em 
gordura (HFD, do inglês “high fat diet”), onde 20% das quilocalorias eram obtidas a 
partir de carboidratos, 20% de proteínas e 60% de lipídeos, totalizando 35,2% de 
lipídeos na composição.  
29 
 
A ração HFD foi produzida em nosso laboratório. Para tal, cada ingrediente foi 
cuidadosamente pesado e homogeneizado com o auxílio de um multiprocessador 
(PHILLIPS/WALITA). A massa originada foi acondicionada em recipientes plásticos e 
mantida congelada (-20°C) até o momento de distribuição nas gaiolas, por um prazo 
máximo de dois meses. Os ingredientes para o preparo dessa ração foram 
adquiridos da empresa PRAGSOLUÇÕES Biociência e a composição está descrita 
na tabela 01.  
 
 
 
 
 
 
 
 
3.3 CULTURA DE CÉLULAS DA LINHAGEM 4T1 
 
 
A linhagem de tumor mamário murino 4T1 nos foi gentilmente cedida pela 
Dra. Adriana Bonomo, da Universidade Federal do Rio de Janeiro. As células foram 
cultivadas em Meio Modificado de Dulbecco’s (DMEM, do inglês “Dulbecco’s 
Modified Eagle’s Medium”) com 4500mg/L de glicose (DMEM high glucose – 
Tabela 01: Componentes da ração rica em gordura (HFD) 
Ingrediente Peso (g) 
Caseína 200,0 
Sacarose 100,0 
Amido de milho 115,5 
Amido Dextrinizado 132,0 
Banha 312,0 
Óleo de soja 40,0 
Celulose 50,0 
Mistura de minerais AIN-93 35,0 
Mistura de vitaminas AIN-93 10,0 
L- Cistina 3,0 
Bitartarato de Colina 2,5 
30 
 
SIGMA), suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB), 1% de L-Glutamina 
(GIBCO) e 1% de antibiótico (100 unidades/ mL de penicilina e 100 ug/mL de 
estreptomicina – GIBCO) a 37°C e 5% de CO2. 
 Após atingirem cerca de 80% de confluência, as células foram lavadas com 
tampão salino fosfato (PBS) 0,15M, pH 7,4 (2,8 mM Na2PO4; 7,2 mM Na2HPO4; 
0,14M NaCl).Em seguida, foram incubadas com solução de Tripsina - EDTA 0,25% 
(GIBCO), durante 5 min., a 37ºC. Após a incubação, a suspensão celular foi 
centrifugada a 1500rpm, durante 5 min., a 4ºC. Para verificação da viabilidade 
celular, depois de ressuspendidas em DMEM, foram diluídas em Azul de Tripan 
0,2% e contadas em Câmara de Neubauer.  
 
 
3.4 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL  
 
 
 Para avaliarmos o impacto da obesidade sobre o crescimento do tumor 
mamário e metástases, utilizamos o modelo de obesidade induzida por dieta 
hiperlipídica. Todo o estudo consistiu de quatro grandes experimentos, conforme 
demonstrado no fluxograma a seguir (Fig. 04). 
 Primeiramente, foi caracterizado o modelo de obesidade. Para isso, os 
animais foram pesados semanalmente e tiveram o consumo de ração controlado.  
Foram realizadas eutanásias após 6, 8, 12 e 16 semanas de dieta para as seguintes 
análises: (i) glicemia de jejum e tolerância à glicose; (ii) quantificação das gorduras 
retroperitoneal e perigonadal; (iii) dosagens de colesterol total e triglicérides no soro 
dos animais acompanhados durante 6, 12 e 16 semanas de dieta, bem como a 
dosagem de leptina.   
No segundo experimento, os animais receberam dieta hiperlipídica ou 
controle durante 6 ou 16 semanas. Ao fim do período de dieta, foram inoculados 
com 5 x 104 células tumorais da linhagem 4T1, concentração previamente definida 
por Kim e colaboradores (2011), e acompanhados durante 50 dias para análise do 
percentual de sobrevida e do volume tumoral.  
Em um terceiro experimento, após serem acompanhados durante 6 ou 16 
semanas de dieta, os animais receberam as células tumorais e foram  eutanasiados 
31 
 
após 14, 17, 24 e 30 dias da injeção para as seguintes análises: (i) quantificação do 
peso do tumoral e da gordura perigonadal; (ii) avaliação de metástases através de 
ensaio clonogênico metastático da medula óssea do ilíaco e dos linfonodos 
drenantes do tumor.  
No quarto experimento, os animais, após 6 ou 16 semanas de dieta, foram 
divididos nos grupos: controle sem tumor (CTR ST), obeso sem tumor (OB ST), 
controle com tumor (CTR 4T1) e obeso com tumor (OB 4T1). As eutanásias 
ocorreram no dia 14 após a injeção do tumor e no dia 35 a fim de analisar a 
concentração das citocinas TNF-α e IL-6 a partir de cultura de células da medula 
óssea do ilíaco, bem como a concentração de leptina no meio condicionado de 
tecido adiposo dos animais alimentados por 16 semanas. 
 
 
  
 
Figura 04: Representação esquemática do delineamento experimental. 
32 
 
Para que pudéssemos acompanhar os animais durante todos os 
procedimentos experimentais, estes foram devidamente identificados através de 
marcação na orelha. A representação esquemática desta identificação pode ser 
observada na figura 05.  
 
 
 
 
 
 
3.5 EUTANÁSIAS  
 
 
As eutanásias foram realizadas por aprofundamento da anestesia utilizando 
Quetamina (100mg/kg) e um relaxante muscular, a Xilazina (10mg/kg), por via 
intraperitoneal, seguidas de exsanguinação por punção cardíaca.  
 
 
3.6 ANÁLISES BIOQUÍMICAS 
 
 
3.6.1 Glicemia  
Figura 05: Desenho esquemático representando a marcação de orelha usada para 
identificação dos animais. 
33 
 
 Para quantificação da glicemia, os animais foram mantidos em jejum por 10h 
e ao final desse período, uma pequena amostra de sangue foi recolhida da veia da 
cauda e a glicemia de jejum quantificada com o auxílio de um glicosímetro (ACCU-
CHECK Performa). Em seguida, os animais receberam, por via intraperitoneal, 2g/kg 
de peso corporal de solução de glicose, na concentração de 100mg/mL para 
realizarmos o teste de tolerância à glicose (TTG). A glicemia foi novamente 
quantificada após 60 minutos.  
 
 
3.6.2 Colesterol e Triglicérides  
 
 
O sangue periférico foi recolhido após a eutanásia dos animais e armazenado 
em tubos do tipo Eppendorfs, a temperatura ambiente, até a retração do coágulo. 
Em seguida, o material foi armazenado em geladeira até o momento da 
centrifugação. As amostras foram então centrifugadas a 14000 rpm, por 3 minutos. 
Os soros foram cuidadosamente aspirados, transferidos para tubos limpos, 
previamente identificados, e armazenados em freezer a – 80°C até o momento do 
processamento. 
Para quantificação de colesterol total e triglicérides, as amostras foram 
enviadas ao Laboratório de Análise Hematológica e Bioquímica do Centro de 
Biologia da Reprodução, da Universidade Federal de Juiz de Fora. As dosagens 
foram realizadas através de método colorimétrico enzimático, utilizando kits 
comerciais Labtest. As leituras foram realizadas através do aparelho Labmax 
Progress®.  
 
 
3.7 QUANTIFICAÇÃO DE LEPTINA 
 
 
34 
 
 A concentração de leptina no soro e no meio condicionado de gordura (obtido 
como descrito no item 3.11) foi determinada por ELISA (R&D Systems), seguindo as 
recomendações apresentadas no protocolo do fabricante.  
A leitura da densidade ótica foi realizada em leitor de microplacas 
(SPECTRAMAX 190, Molecular Devices) a 450 nm. 
 Os cálculos das concentrações obtidas foram realizados a partir da curva 
padrão, obtida das diferentes concentrações do anticorpo recombinante.   
 
 
3.8 INDUÇÃO DO MODELO DE CÂNCER DE MAMA ORTOTÓPICO IN VIVO 
 
 
Após seis ou dezesseis semanas do início da dieta, os animais receberam 5 x 
104 células 4T1 (Kim et al., 2011), num volume total de 100uL, injetadas no tecido 
subcutâneo, na região da primeira glândula mamária inguinal direita (Fig. 06). No 
experimento em que se fez necessário a existência de grupos controle e obesos 
sem tumor, os animais receberam solução fisiológica 0,9%, injetada na mesma 
região e em igual volume dos animais que receberam as células tumorais. 
Todos os animais continuaram sendo alimentados com as respectivas dietas 
até o momento da eutanásia. 
  
 
3.9 QUANTIFICAÇÃO DO VOLUME DO TUMOR 
 
 
 O volume tumoral foi mensurado com o auxílio de um paquímetro após 14, 
17, 24 e 30 dias da indução e calculado de acordo com a fórmula: diâmetro maior x 
(diâmetro menor)2 x 0,52 (KIM et al., 2011).  
35 
 
 
 
 
  
 
 
3.10 ENSAIO CLONOGÊNICO METASTÁTICO 
 
 
 Para realização deste ensaio, foram utilizadas células dos linfonodos 
periféricos drenantes do tumor e células da medula óssea do ilíaco.  
 Os linfonodos foram removidos e macerados sob um pedaço de tecido de 
algodão (Trama 40 – Voil) em meio DMEM suplementado com 10% de SFB.  
 Os ossos ilíacos foram recolhidos e incubados por 1h, a 37°C, em meio 
DMEM, suplementado com 10% de SFB, 0,5mg/mL de colagenase tipo I (SIGMA- 
ALDRICH) e 100ug/mL de DNAse (SIGMA- ALDRICH). Ao término da incubação, os 
ossos foram macerados com o auxílio de cadinho e pistilo e o produto da maceração 
foi filtrado em filtro do tipo “cell strainer” de 40um.  
 As suspensões celulares foram centrifugadas a 1500rpm, a 4°C, por 5 
minutos. Em seguida, os “pellets” foram ressuspensos e as células contadas em 
Figura 06: Desenho esquemático demonstrando a localização 
anatômica das glândulas mamárias e o local de injeção das células 
tumorais. (Adaptado de Murphy E.D., chapter 27 Characteristic 
Tumors, in E.L. Green Ed., "Biology of the Laboratory Mouse"). 
36 
 
Câmara de Neubauer, diluídas em Azul de Tripan 0,2% para avaliação da viabilidade 
celular.  
 Em placas de cultura de 6 poços, foram plaqueadas 106 células/mL. A partir 
dessa diluição, diluições seriadas foram realizadas até que se atingisse a 
concentração mínima de 10 células/mL. A cultura foi mantida a 37°C e 5% de CO2 
por 14 dias. Ao término desse período, os sobrenadantes foram descartados, as 
placas lavadas com PBS, fixadas com Metanol e coradas com Azul de Metileno 1%. 
Os aglomerados de células tumorais, corados em azul, puderam então ser 
quantificados. 
 
 
3.11 MEIO CONDICIONADO DE GORDURA 
 
 
 Para produção do meio condicionado de gordura, a gordura perigonadal foi 
removida e colocada em cultura em meio DMEM não suplementado com SFB, na 
proporção de 1g/mL. A cultura foi mantida a 37°C e 5% de CO2 por 24h. Ao final 
deste período, o sobrenadante foi recolhido, aliquotado e mantido a -80°C até sua 
utilização.  
A título de ilustração, a localização anatômica das gorduras retroperitoneal e 
perigonadal pode ser observada na figura abaixo (Fig. 07). 
 
 
3.12 CULTURA DE CÉLULAS ESTIMULADAS COM ANTI-CD3 
 
 
 As células da medula óssea foram obtidas do osso ilíaco após incubação por 
1h, a 37°C, em meio DMEM, suplementado com 10% de SFB, 0,5mg/mL de 
colagenase tipo I (SIGMA- ALDRICH) e 100ug/mL de DNAse (SIGMA- ALDRICH) e 
maceração com o auxílio de cadinho e pistilo.  Em seguida, suspensão celular obtida 
foi centrifugada a 1500rpm, 4°C, por 5 minutos. Os “pellets” foram ressuspensos e 
37 
 
contados em Câmara de Neubauer, excluindo-se as células inviáveis com a 
utilização de Azul de Tripan 0,2%.  
 Uma concentração de 107 células/mL foi colocada em cultura, em placas de 
96 poços, por 72h. Para essa cultura foi utilizado DMEM suplementado com 10% de 
SFB e acrescido de 1ug/mL de anti-CD3. Ao final do período de cultura, as placas 
foram centrifugas a 1500rpm, 4°C, por 5 minutos. Os sobrenadantes foram 
recolhidos, aliquotados e armazenados a -80°C.  
 
 
 
 
 
 
 
3.13 DOSAGEM DE CITOCINAS  
 
 
 A concentração de citocinas no sobrenadante de cultura de células da medula 
óssea foi determinada por ELISA. Foram utilizados kits comerciais (R&D Systems) 
Figura 07: Desenho esquemático demonstrando a 
localização anatômica das gorduras retroperitoneais e 
perigonadais. (Adaptado de (“The Anatomy of the 
Laboratory Animals” – A Anatomia de Animais de 
Laboratório de Margareth J. Cook, 1965) 
38 
 
das citocinas TNF-α e IL-6. Os ensaios foram realizados em duplicatas, seguindo as 
recomendações dos protocolos do fabricante.  
 A leitura da densidade ótica foi realizada em leitor de microplacas 
(SPECTRAMAX 190, Molecular Devices), a 450nm.  
 A quantificação das citocinas foi calculada a partir das curvas padrão, obtidas 
das diferentes concentrações dos respectivos recombinantes (TNF-α e IL-6).  
 
 
3.14 ANÁLISE ESTATÍSTICA 
 
 
 A confecção dos gráficos e as análises estatísticas foram realizadas através 
do programa GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software). Foram utilizadas análises 
de variância (ANOVA) de um fator, seguidas de pós-teste de Bonferroni. As médias 
foram consideradas diferentes quando a probabilidade de serem iguais foi menor 
que 5% (p ≤ 0,05), de acordo com os testes indicados.  
39 
 
4 RESULTADOS 
 
 
4.1 AVALIAÇÃO DO MODELO DE OBESIDADE 
 
 
 Para determinar qual seria o melhor tempo de dieta capaz de induzir ganho 
de peso corporal compatível com o quadro de obesidade, em camundongos BALB/c 
fêmeas, os animais foram alimentados com a dieta controle ou com HFD por 16 
semanas e pesados semanalmente ao longo desse período. O consumo de ração 
também foi controlado.  
Foi observado aumento significativo de peso dos animais alimentados pela 
dieta HFD, designados como obesos, a partir da segunda semana de dieta, 
conforme demonstrado na figura 08a. Durante todo o período, o consumo de ração 
dos animais obesos foi menor que o dos animais controle (Fig. 08b), indicando que o 
ganho de peso se deve a ingestão de uma dieta rica em lipídeos e não a hiperfagia. 
Houve também aumento das gorduras retroperitoneal e perigonadal nos 
animais obesos em relação aos controles a partir de 12 semanas de dieta. (Fig. 09).  
 
 
 
 
40 
 
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Controle
Obeso
** ***
*** *** *** ***
**
***
***
*** *** *** ***
***
Semanas de dieta
Pe
so
 c
o
rp
or
al
 
(g
)
 
0 4 6 8 12 16
0
1
2
3
4
5
Controle
*
Obeso
** ***
**
**
***
Semanas de dieta
Co
n
su
m
o
 
de
 
ra
çã
o
(g)
/d
ia
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 08: Animais obesos apresentam aumento do peso 
corporal sem aumentar o consumo de ração.  a. Ganho de peso 
corporal ao longo de dezesseis semanas de dieta. b. Consumo 
médio diário de ração por animal ao longo de dezesseis semanas 
de dieta. Cada ponto representa a média ± o desvio padrão (SD, 
do inglês “standard deviation”). * p≤0,05; ** p≤0,01; *** p≤0,001; 
significativamente diferente do grupo controle (n=25). 
a. 
b. 
41 
 
0.0
0.3
0.6
0.9
1.2
1.5
1.8
2.1
2.4
2.7
Obeso
Controle
8 semanas 12 semanas 16 semanas
***
***
Pe
so
 
(g
)
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
Obeso
Controle
8 semanas 12 semanas
**
16 semanas
***
Pe
so
 
(g
)
 
 
 
 
 
Os animais submetidos ou não a dieta também passaram por caracterização 
do perfil bioquímico.  
Sabendo que a obesidade e o diabetes tipo 2 são doenças fortemente 
relacionadas, foi avaliado  o índice glicêmico, analisando a glicemia de jejum e a 
tolerância a glicose, através de TTG.  Foi constatado um aumento da glicemia dos 
animais obesos após receberem glicose a partir de 6 semanas de dieta (Fig. 10). 
Este é um indício de menor tolerância à glicose no grupo obeso, podendo indicar 
uma alteração metabólica ao nível resistência à insulina. Inoue et al., em 2012, 
encontraram resultados semelhantes ao avaliar camundongos C57BL/6 alimentos 
com HFD por 12 semanas. 
 
 
Figura 09: Aumento do peso das gorduras retroperitoneal (a.) e 
perigonadal (b.) ao longo de dezesseis semanas de dieta nos animais 
obesos. Cada barra representa a média ± SD. ** p≤0,01; *** p≤0,001; 
significativamente diferente do grupo controle (n=5). 
 
≤0,0 ≤0,001
a. 
b. 
42 
 
0' 0' 60' 60' 0' 0' 60' 60' 0' 0' 60' 60' 0' 0' 60' 60'
0
30
60
90
120
150
180
210
240
6 semanas 8 semanas 16 semanas12 semanas
Controle
Obeso
G
lic
em
ia
 
(m
g/
dL
)
*** **
*
*
 
 
 
 
 A leptina, um dos principais hormônios associados à obesidade, também foi 
quantificada. Conforme demonstrado na figura 11, a partir de 12 semanas de dieta, 
os animais obesos já apresentavam níveis significativamente maiores de leptina no 
soro, e após 16 semanas, a diferença nos níveis de leptina entre animais obesos e 
controle era acentuadamente maior. 
 
0
1000
2000
3000
4000 Controle
Obeso
*
**
*
6 semanas 8 semanas 12 semanas 16 semanas
Le
pt
in
a 
(p
g/
m
L)
 
 
Figura 10: Diminuição da tolerância à glicose, com aumento da glicemia de 
animais obesos. A glicemia foi quantificada em jejum (0’) e após 60 minutos do 
inicío do TTG (60’). Cada barra representa a média ± SD. * p≤0,05; ** p≤0,01; *** 
p≤0,001; significativamente diferente do grupo controle (n=5). 
 
 
Figura 11: Aumento da concentração de leptina no soro de animais 
obesos. Cada barra representa a média ± SD. * p≤0,05; ** p≤0,01; 
significativamente diferente do grupo controle (n=5). 
43 
 
 Os níveis de colesterol total e triglicérides também foram avaliados, visto que 
há uma forte correlação entre obesidade e hiperlipidemia. Observou-se aumento do 
colesterol total dos animais que receberam a dieta rica em lipídeos após 6, 12 e 16 
semanas de dieta (Fig. 12). No entanto, os níveis de triglicérides foram semelhantes 
entre os animais alimentados pela dieta padrão e hiperlipídica (Fig.13). O aumento 
dos níveis de colesterol total e triglicérides foram observados por Inoue e 
colaboradores, em 2012.  
 
 
 
0
30
60
90
120
150
Controle
Obeso
6 semanas 12 semanas 16 semanas
*** ***
***
Co
le
st
er
o
l T
o
ta
l (m
g/
dL
)
 
 
 
0
50
100
150
200
Controle
Obeso
6 semanas 12 semanas 16 semanas
Tr
ig
lic
ér
id
es
 
(m
g/
dL
)
 
 
Figura 12: Aumento dos níveis de colesterol total nos animais alimentados 
pela HFD. Cada barra representa a média ± SD. *** p≤0,001; 
significativamente diferente do grupo controle (n=5). 
Figura 13: Níveis de triglicérides não foram alterados pela ingestão da 
HFD. Cada barra representa a média ± SD. (n=5). 
44 
 
Diante dos resultados obtidos até o momento, sugerimos que nossos animais 
alimentados com uma dieta rica em lipídeos por 16 semanas desenvolveram um 
quadro característico de obesidade, com aumento do peso corporal, das gorduras 
retroperitoneal perigonadal, bem como alterações significativas em importantes 
parâmetros bioquímicos associados à obesidade, podendo apresentar alterações 
metabólicas características dessa doença. No entanto, para que pudéssemos avaliar 
os possíveis efeitos da idade sobre a resposta imunológica ao tumor, animais 
alimentados por 6 semanas de dieta foram também analisados.  
 
 
4.2 INFLUÊNCIA DA HFD NA SOBREVIDA, NO CRESCIMENTO TUMORAL E NO 
DESENVOLVIMENTO DE METÁSTASES  
 
 
 A disfunção metabólica característica da obesidade leva a um estado 
inflamatório crônico nos indivíduos obesos. É bem documentado que este 
microambiente inflamatório, rico em citocinas pró-inflamatórias, fatores de 
crescimento e diversas células do sistema imunológico torna-se um ambiente 
propício ao desenvolvimento de tumores (GILBERT e SLINGERLAND, 2012). Assim, 
foi primeiramente avaliada a influência do consumo da HFD sobre a sobrevida 
destes animais, o crescimento tumoral e o estabelecimento de metástases tumorais.  
 Os animais dos grupos controle e obeso receberam as respectivas dietas por 
6 ou 16 semanas e ao final foram inoculados com 5 x 104 células 4T1, num volume 
total de 100ul, por via subcutânea, na região da primeira glândula mamária inguinal 
direita. Estes animais tiveram o peso corporal quantificado semanalmente, bem 
como o consumo de ração, durante todo o período experimental. Já a partir da 
segunda semana de dieta, houve um aumento do peso corporal (Fig. 14a. e 14c.). O 
consumo de ração dos animais obesos foi menor que o dos controles em todo o 
período (Fig.14b. e 14d). Após 6 semanas da injeção do tumor, os animais obesos 
alimentados por 16 semanas, apresentaram diminuição do peso corporal, não 
associada a uma menor ingestão de ração, conforme demonstrado na figura 14.   
  
45 
 
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
0
5
10
15
20
25
30
35
Controle
Obeso
*** *** ***
*** ***
***
*** *** ***
***
**
Injeção das
céls 4T1
Semanas de dieta
Pe
so
 
co
rp
o
ra
l (g
)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
0
1
2
3
4
5
6
7
Controle
Obeso
Injeção das
céls 4T1
*
***
*** ***
***
***
***
***
***
***
***
***
Semanas de dieta
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o
 
m
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/d
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0 6 12 16 17 18 19 20 21 22 23
0
1
2
3
4
Controle
Obeso
***
Injeção das
céls 4T1
***
***
***
***
***
***
*** ***
***
***
Semanas de dieta
Co
n
su
m
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m
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)/d
ia
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011121314151617181920212223
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Controle
Obeso
Injeção das
céls 4T1
**
***
*** *** *** ***
**
***
***
*** ***
*** ***
***
***
*** ***
***
***
Semanas de dieta
Pe
so
 
c
o
rp
o
ra
l (
g)
 
 
 
 
 
 
 Ao avaliarmos a sobrevida dos animais controles e obesos, alimentados 
durante 6 semanas de dieta, após receberem as células tumorais, observamos 
menor percentual de sobrevivência dos animais controles em torno de 40 dias após 
a injeção do tumor (Fig. 15a.). No entanto, a sobrevida dos animais obesos 
alimentados durante 16 semanas de dieta foi menor que a dos animais controles, 
embora não tenham sido observadas diferenças significativas (Fig. 15b.). Aos 44 
dias após a injeção do tumor, 33% dos animais controles ainda sobreviviam, contra 
22% de obesos. Aos 55 dias, a sobrevida de controles era de 22%, enquanto que a 
de obesos era de apenas 11%. Essa menor sobrevida dos animais obesos, 
alimentados por um longo período com uma dieta rica em lipídeos, pode estar 
associada a um pior prognóstico tumoral, com aumento de metástases, favorecido 
pelo estado inflamatório gerado pelo acúmulo de tecido adiposo.  
Figura 14: Animais alimentados pela HFD durante 16 semanas apresentam diminuição do peso corporal 
após a injeção do tumor. a. Peso corporal (g) dos animais alimentados durante 6 semanas. b. Consumo 
de ração (g/dia) dos animais alimentados por 6 semanas. c.  Peso corporal (g) dos animais 
acompanhados durante 16 semanas de dieta. d. Consumo de ração (g/dia) dos animais acompanhados 
durante 16 semanas de dieta. Cada ponto representa a média ± SD. ** p≤0,01; *** p≤0,001; 
significativamente diferente do grupo controle (n=20). 
a. b. 
c. d. 
46 
 
 
0 10 20 30 40 50 60
0
20
40
60
80
100
120
Controle
Obeso
Dias
So
br
ev
id
a 
(%
)
 
0 10 20 30 40 50 60
0
20
40
60
80
100
120
Controle
Obeso
Dias
So
br
ev
id
a 
(%
)
 
 
  
 
 
A fim de avaliar a influência da obesidade no tamanho do tumor e no 
desenvolvimento de metástases nestes animais, tanto nos alimentados durante 6 
semanas quanto nos alimentados por 16 semanas, os mesmos foram eutanasiados 
após 14, 17, 24 e 30 dias da injeção do tumor. A gordura perigonadal foi removida e 
pesada. Foi observada diminuição do peso da gordura perigonadal dos animais 
obesos com o avanço do estágio de desenvolvimento do tumor (Fig. 16).  
Figura 15: Mortalidade de animais controles e obesos, alimentados por 6 (a.) 
ou 16 semanas de dieta (b.), após receberem as células tumorais.  
Todos os animais receberam 5x104 células 4T1 e tiveram a mortalidade 
avaliada pela curva de sobrevida de Kaplan-Meier. (n=10) 
a. 
b. 
47 
 
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
Controle
Obeso
14 dias 17 dias 24 dias 30 dias
***
***
*
#
Pe
so
 
G
o
rd
.
 
PG
 
(g
)
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
2.2
2.4
2.6
14 dias 17 dias 24 dias 30 dias
Controle
Obeso
#
***
***
***
Pe
so
 
G
o
rd
.
 
PG
 
(g)
*
  
  
 
 
 
O peso e o volume tumoral foram avaliados e, com o avanço da doença, 
houve aumento significativo do peso e do volume do tumor dos animais obesos 
acompanhados durante 16 semanas de dieta, conforme demonstrado nas figuras 
17c. e 17d., respectivamente.  
Figura 16: Peso da gordura perigonadal (PG) dos animais alimentados por 6 (a.) ou 
16 semanas de dieta (b.) após receberem o tumor. Cada barra representa a média ± 
SD. * p≤0,05; *** p≤0,001; significativamente diferente do grupo controle. # p≤0,05, 
quando os grupos de 14 e 30 dias foram comparados (n=5).  
a. 
b. 
48 
 
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
Controle
Obeso
14 dias 17 dias 24 dias 30 dias
Pe
so
 
do
 
tu
m
o
r 
(g)
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
5.5
6.0
Controle
Obeso
14 dias 17 dias 24 dias 30 dias
Vo
lu
m
e 
do
 
tu
m
o
r 
(cm
3 )
 
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
14 dias 17 dias 24 dias
Controle
Obeso
30 dias
***
Pe
so
 
do
 
tu
m
o
r 
(g)
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
14 dias 17 dias 24 dias 30 dias
Controle
Obeso
***
Vo
lu
m
e 
do
 
tu
m
o
r 
(cm
3 )
 
 
 
 
 
 
 Uma vez que os animais obesos alimentados durante 16 semanas 
apresentavam tumor de maior peso e de maior volume quando comparados aos 
animais controle, inferimos que apresentariam também mais metástases ósseas e 
isso foi comprovado através do Ensaio Clonogênico Metastático. Interessantemente 
um aumento progressivo dos clones de células 4T1 foi observado na medula óssea 
dos animais obesos, com diferença significativa em relação aos controles após 30 
dias da injeção do tumor (Fig. 18). Resultados semelhantes foram observados ao se 
avaliar a existência de metástases no linfonodo inguinal, drenante do tumor (Fig. 19), 
no entanto, por se tratar da análise de um único experimento onde foi obtido um 
“pool” de linfonodos, não foi realizado nenhum teste estatístico.  
  
Figura 17: Animais obesos alimentados durante 16 semanas de dieta apresentam tumores de 
maior peso e volume. a. – b. Peso e volume do tumor de animais acompanhados durante 6 
semanas de dieta. c. – d. Peso e volume do tumor de animais acompanhados durante 16 semanas 
de dieta. Os diâmetros do tumor foram mensurados com o auxílio de um paquímetro e o volume 
calculado aplicando-se a fórmula: (diâmetro maior) x (diâmetro menor)2 x 0,52. Cada barra 
representa a média ± SD. *** p≤0,001; significativamente diferente do grupo controle (n=5).  
a. b. 
c. d. 
49 
 
 
14 17 30
0
20
40
60
80
Controle
Obeso
Dias após injeção do tumor
N
úm
er
o
 
de
 
cl
o
n
es
 
x
 
10
6
cé
ls
14 17 30
0
10
20
30
40
Controle
Obeso
*
Dias após injeção do tumor
N
úm
er
o
 
de
 
cl
o
n
es
 
x 
10
6
cé
ls
 
  
  
 
 
Figura 18: Animais obesos, alimentados durante 16 semanas de dieta, 
apresentam aumento de metástases na medula óssea. a. Clones de células 
tumorais presentes na medula óssea dos animais alimentados durante 6 semanas 
de dieta. b. Clones de células tumorais presentes na medula óssea dos animais 
alimentados durante 16 semanas de dieta. Cada ponto representa a média ± SD. 
* p≤0,05; significativamente diferente do grupo controle (n=5).  
a. 
b. 
50 
 
14 17 30
0
20
40
60
Controle
Obeso
Dias após injeção do tumor
N
úm
er
o
 
de
 
cl
o
n
es
 
x
 
10
6
cé
ls
 
14 17 30
0
20
40
60
80
Controle
Obeso
Dias após injeção do tumor
N
úm
er
o
 
de
 
cl
o
n
es
 
x 
10
6
cé
ls
 
  
 
 
 
 
A diminuição da gordura perigonadal dos animais alimentados com a HFD por 
16 semanas, associada também a diminuição do peso corporal, pode demonstrar 
estado de caquexia dos animais, acompanhado de grande número de metástases 
tumorais. A este estágio avançado de doença também pode ser associada a maior 
mortalidade dos animais obesos alimentados durante 16 semanas de dieta, mesmo 
que não significativa.  
Figura 19: Animais obesos tendem a apresentar mais metástases no linfonodo inguinal 
drenante do tumor. a. Clones de células tumorais presentes no linfonodo drenante do 
tumor dos animais alimentados durante 6 semanas de dieta. b. Clones de células 
tumorais presentes no linfonodo drenante do tumor dos animais alimentados durante 16 
semanas de dieta Resultados apresentados sem análise estatística, uma vez que são 
referentes a um ensaio realizado com um “pool” de linfonodos.  
a. 
b. 
51 
 
Em conjunto, estes resultados podem indicar a existência de um carcinoma 
mamário mais agressivo nos animais obesos, acompanhados durante 16 semanas 
de dieta, quando comparados aos controles.  
 
 
4.3 INFLUÊNCIA DA HFD NO PERFIL DE CITOCINAS PRÓ INFLAMATÓRIAS 
 
 
 Diversos trabalhos demonstram uma correlação positiva entre níveis alterados 
de citocinas inflamatórias, obesidade e desenvolvimento de tumores. Desta forma, 
nós avaliamos o perfil das citocinas pró-inflamatórias IL-6 e TNF-α, bem como os 
níveis de leptina, dos animais controle e obesos em dois estágios de 
desenvolvimento do tumor. 
 A leptina é o principal hormônio associado à obesidade. Derivada, 
principalmente, do tecido adiposo, é capaz de induzir a secreção de citocinas como 
IL-6 e TNF-α, além de alterar perfis de diversas células do sistema imunológico. A 
quantificação dos níveis de leptina no meio condicionado de gordura dos animais 
acompanhados durante 16 semanas de dieta e que receberam ou não células 
tumorais, demonstrou que os animais alimentados com a dieta HFD apresentaram 
níveis significativamente maiores de leptina (Fig. 20). Os animais que receberam as 
células tumorais, aos 35 dias após a injeção do tumor, tempo em que foi observado 
estágio avançado de desenvolvimento do tumor, com grande número de 
metástases, apresentaram drástica redução dos níveis de leptina, associada 
também a diminuição da gordura perigonadal nestes mesmos animais, conforme 
demonstrado na figura 16. Estes achados indicam que a leptina pode ter papel 
crucial no estabelecimento e na progressão inicial do tumor, induzindo fatores de 
crescimento capazes de favorecer o desenvolvimento de metástases. Além disso, foi 
demonstrado por Wazir e colaboradores, em 2012, a expressão de leptina e seu 
receptor em amostras do carcinoma mamário humano MCF-7, sugerindo que esta 
pode estar envolvida na progressão tumoral. 
 
52 
 
0
5000
10000
15000
20000
25000
14d ST 14d 4T1 35d ST 35d 4T1
Controle
Obeso
***
***
***

#
*Le
pt
in
a 
(pg
/m
L)
 
 
 
 
 
 
 
 
 Ao avaliarmos os níveis de IL-6 nos sobrenadantes de cultura da medula 
óssea do ilíaco, observamos que os animais obesos, alimentados por 16 semanas, 
que receberam tumor, após 35 dias da injeção do mesmo, apresentaram diminuição 
significativa da expressão desta citocina (Fig. 21b.). Os animais alimentados durante 
6 semanas não apresentaram diferenças significativas na expressão desta citocina 
(Fig. 21a.). 
 
 
Figura 20: Animais obesos apresentam maior expressão de leptina no meio 
condicionado de tecido adiposo. As análises foram realizadas em animais 
controles e obesos, acompanhados durante 16 semanas de dieta, sem tumor 
(ST) e com tumor (4T1), após 14 e 35 dias da injeção do tumor (14d e 35d). 
Cada barra representa a média ± SD. * p≤0,05; *** p≤0,001; significativamente 
diferente do grupo controle; x p≤0,001, quando os grupos obesos de 35 dias 
foram comparados entre si; # p≤0,001, quando o grupo obeso com 14 dias de 
tumor foi comparado ao grupo obeso com 35 dias de tumor. (n=5).  
 
53 
 
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
14d ST 14d 4T1 35d ST 35d 4T1
Controle
Obeso
IL
-
6 
(pg
/m
L)
0
100
200
300
400
500
600
700
800
14d ST 14d 4T1 35d ST 35d 4T1
Controle
***
IL
-
6 
(p
g/
m
L)
Obeso
 
 
 
 
 
 A expressão de TNF-α também foi alterada.  A análise desta citocina no 
sobrenadante de cultura de medula óssea do ilíaco revelou que os animais obesos 
alimentados por 16 semanas e que receberam o tumor apresentaram diminuição da 
expressão TNF-α, tanto aos 14 quanto aos 35 dias após a injeção do tumor (Fig. 
22b.). Não foram observadas diferenças significativas na expressão desta citocina 
na cultura de medula óssea dos animais acompanhados durante 6 semanas de dieta 
(Fig. 22a.). 
 
Figura 21: Expressão alterada de IL-6 em cultura de medula óssea do ilíaco. As 
análises foram realizadas em animais controles e obesos, alimentados durante 6 (a.) 
ou 16 semanas (b.), sem tumor (ST) e com tumor (4T1), após 14 e 35 dias da injeção 
do tumor (14d e 35d). Cada barra representa a média ± SD. *** p≤0,001; 
significativamente diferente do grupo controle; (n=5).  
 
b. 
a. 
54 
 
0
50
100
150
200
250
14d ST 14d 4T1 35d ST 35d 4T1
Controle
Obeso
TN
F-
 (pg
/m
L)
0
500
1000
1500
2000
2500
14d ST 14d 4T1 35d ST 35d 4T1
Controle
***
*
*
TN
F-
 (pg
/m
L)
Obeso
 
 
 
 
  
 
Conforme demonstrado, aos 35 dias após a injeção do tumor, houve 
diminuição significativa da gordura perigonadal, dos níveis de leptina, TNF-α e IL-6. 
Desta forma, parece que a leptina, aliada a outras alterações, possui papel 
fundamental no desenvolvimento de tumores dos animais obesos.  
 
   
Figura 22: Expressão de TNF-α no sobrenadante de cultura de medula óssea do 
ilíaco de animais acompanhados durante 6 (a.) ou 16 semanas de dieta (b.). As 
análises foram realizadas em animais controles e obesos, sem tumor (ST) e com 
tumor (4T1), após 14 e 35 dias da injeção do tumor (14d e 35d). Cada barra 
representa a média ± SD. * p≤0,05; *** p≤0,001; significativamente diferente do 
grupo controle; (n=5).  
 
b. 
a. 
55 
 
5 DISCUSSÃO 
 
 
 A obesidade atingiu proporções epidêmicas em todo o mundo. Comumente 
associada a países de alta renda, a obesidade é também prevalente em países de 
renda baixa e média. Estima-se que pelo menos 2,8 milhões de pessoas morram a 
cada ano como resultado de excesso de peso ou obesidade. Além disso, 44% dos 
casos de diabetes , 23% dos casos de doenças isquêmicas do coração e entre 7% e 
41% de determinados casos de câncer são atribuídos ao excesso de peso e 
obesidade (WHO, 2013).  
O desenvolvimento de tumores, como por exemplo, o câncer de mama, está 
altamente associado a inflamação e as alterações imunometabólicas características 
dos quadros de obesidade. Contudo, novos estudos ainda são necessários para 
entender esta complexa relação.  
No presente estudo, foi avaliado o impacto da obesidade no estabelecimento 
do tumor de mama e metástases, a partir do perfil imunológico do animal obeso que 
recebeu a linhagem de célula tumoral 4T1. 
Primeiramente, o ganho de peso corporal, a ingestão alimentar, o ganho de 
gordura retroperitoneal e perigonadal, a glicemia e o perfil lipídico de animais 
alimentados com dieta controle ou HFD ao longo de 16 semanas foi analisado. 
Em 2010, Olson e colaboradores caracterizaram os camundongos BALB/c 
como animais resistentes a obesidade por apresentarem um pequeno ganho de 
peso corporal ao serem alimentados com HFD por um longo período. Kim e 
colaboradores (2011) e Zhao e colaboradores (2013) compartilharam esta ideia. 
Nossos resultados demonstram ganho de peso corporal nos animais HFD 
comparados aos controles já a partir da segunda semana de dieta, além de menor 
consumo de ração por esses animais; aumento de peso das gorduras retroperitoneal 
e perigonadal a partir de 12 semanas de dieta; menor tolerância à glicose; aumento 
dos níveis de leptina e colesterol total, corroborando os resultados apresentados em 
estudos realizados com camundongos C57BL/6, alimentados com HFD por 
diferentes períodos (KIM et al., 2011; INOUE et al., 2012). As alterações de peso 
corporal, gordura retroperitoneal e perigonadal, além de alterações em importantes 
56 
 
parâmetros bioquímicos associados à obesidade, caracterizam os animais 
alimentados com HFD como obesos.  
Ao observar a influência da HFD na sobrevida dos animais, no crescimento 
tumoral e no estabelecimento de metástases, foi observado que os animais obesos, 
alimentados pela HFD durante 16 semanas, apresentaram menor sobrevida, embora 
sem significância estatística, aumento do peso e do volume do tumor, bem como 
aumento dos clones de células tumorais na medula óssea do ilíaco. Estes animais 
também apresentaram diminuição do peso corporal e da gordura perigonadal, 
sugerindo um estado de caquexia associado ao avanço do tumor. Em conjunto, 
estes resultados indicam de que os animais obesos apresentam carcinoma mais 
agressivo quando comparados aos controles.  
Kim e colaboradores, em 2011, observaram aumento de nódulos tumorais no 
pulmão e no fígado de animais que receberam células 4T1 e foram alimentados com 
HFD, além de maior volume e peso do tumor desses animais, e menor sobrevida, 
ratificando nossos resultados. 
Ainda, Zhao e colaboradores, em 2013, ao avaliar a influência da ingestão de 
HFD no desenvolvimento da glândula mamária durante a puberdade, observaram 
que os animais alimentados pela HFD e tratados com 7,12- dimetilbenz(a)antraceno 
(DMBA), um agente tumorigênico, apresentaram aumento do número de eosinófilos 
na glândula mamária,  aumento do número de lesões epiteliais anormais, maior 
proliferação celular, aumento de RANKL nas células epiteliais na mama, aumento da 
vascularização e de macrófagos M2 quando comparados aos animais que 
receberam a dieta padrão. Entretanto, os animais alimentados pela HFD não 
apresentaram ganho significativo de peso corporal, assim como não apresentaram 
grandes alterações nos níveis de glicose, insulina, estrógeno e progesterona. 
A ingestão de HFD também foi associada ao aumento dos níveis de Ki67, 
ciclina A e D1, Bcl-x, Bcl-2, CD31, VEGF no tecido tumoral, além de alterações nos 
níveis séricos de insulina, IFN-Ȗ, leptina e MCP-1.  O crescimento de tumores 
sólidos, o número e o volume dos nódulos tumorais no pulmão dos animais 
alimentados pela HFD também foram aumentados, observando-se discreto aumento 
do peso corporal (PARK et al., 2012). 
Ao avaliar os efeitos da HFD sobre a progressão do câncer de mama da 
linhagem celular MCF-7 em camundongos BALB/c atímicos, Lamas e colaboradores, 
2013, observaram que, apesar de não apresentarem aumento do peso corporal, nos 
57 
 
animais alimentados pela HFD o crescimento tumoral foi aumentado, bem como a 
expressão de Ki67, um marcador de proliferação celular; enquanto que a 
citoxicidade de células NK do baço foi diminuída, demonstrando que a ingestão da 
HFD pode contribuir para a modulação de diversas funções celulares.  
A literatura mostra evidências indicando que na obesidade há uma diminuição 
da maturação de pré-adipócitos em adipócitos, bem como uma ruptura do equilíbrio 
de duas grandes adipocinas: a leptina e a adiponectina. A adiponectina é anti-
angiogênica, anti-proliferativa e promove a maturação de adipócitos. Adipócitos 
maduros produzem leptina e adiponectina, enquanto que pré-adipócitos secretam 
altos níveis de leptina (SIMONS et al.,2005; VONA-DAVIS e ROSE, 2009). 
 Em indivíduos obesos, há alta expressão de leptina e baixa expressão de 
adiponectina. Na inflamação crônica em obesos, as citocinas pró-inflamatórias, tais 
como TNF-α, IL-1ȕ e IFN-Ȗ tem a capacidade de bloquear a maturação dos pré-
adipócitos, aumentando ainda mais a produção de leptina. (SIMONS et al.,2005). A 
alta concentração de leptina no local atrai monócitos e promove a conversão destes 
em macrófagos. Os macrófagos contribuem para a produção local de citocinas pró-
inflamatórias e fatores pró-angiogênicos (NAUGLER e KARIN, 2008; VONA-DAVIS e 
ROSE, 2009; ROBERTS, DIVE e RENEHAN, 2010).  
A produção de citocinas pelos pré-adipócitos pode ser estimulada pelos 
elevados níveis de ácidos graxos circulantes observados em obesos. Os ácidos 
graxos circulantes, por sua vez, podem ativar a sinalização via receptor Toll-like 4 
(TLR4) e aumentar a secreção de IL-6, CCL2, CCL5 e CCL11, prejudicando a 
diferenciação dos pré-adipócitos em adipócitos (POULAIN-GODEFROY e 
FROGUEL, 2007).  
Muitos estudos têm demonstrado que o aumento dos níveis circulantes de IL-
8, IL-6, CCL2 e CCL5 estão associados a um pior prognóstico em casos de câncer 
(revisado por GILBERT e SLINGERLAND, 2012). 
A IL-6 é uma citocina pró-inflamatória envolvida em diversos processos 
fisiológicos e patológicos do organismo, tais como: respostas imunes, hematopoiese, 
respostas de fase aguda e inflamação. Pode também atuar como fator de 
crescimento de tumores, contribuindo para a recorrência e metástases de câncer de 
mama, inibindo a apoptose das células tumorais, promovendo a angiogênese e 
aumentando a adesão de células tumorais disseminadas (SEMESIUK et al., 2013; 
TRIPSIANIS et al., 2013). 
58 
 
O TNF-α tem sido demonstrado como um dos principais mediadores 
inflamatórios e é capaz de alterar a expressão de fatores de crescimento e outras 
citocinas através de diversas vias de transdução de sinais (SEMESIUK et al., 2013). 
Soria e colaboradores, em 2011, demonstraram que o TNF-α é pouco expresso 
pelas células epiteliais mamárias normais, mas sua incidência é significativamente 
elevada em células tumorais, indicando que esta citocina pode estar relacionada à 
progressão do câncer de mama. 
Foi demonstrado por Lysaght e colaboradores, em 2011, que o aumento de 
leptina e TNF-α induz a secreção de IL-6 pelos adipócitos e esta secreção 
aumentada de IL-6 está relacionada à transcrição de proteínas sinalizadoras ligadas 
a proliferação e invasão de células tumorais. Além disso, a capacidade de animais 
obesos apresentarem tumores de cólon mais proeminentes foi associada a maior 
expressão de TNF-α, demonstrado por Flores e colaborados, em 2012.  
Nossos resultados demonstram redução da expressão de IL-6 e TNF-α no 
sobrenadante de cultura de medula óssea dos animais obesos, alimentados durante 
16 semanas de dieta, aos 35 dias após a injeção do tumor. Associada a diminuição 
destas citocinas, foi observada redução de cerca de três vezes na expressão de 
leptina no meio condicionado de gordura quando os animais obesos com 14 dias de 
tumor foram comparados aos obesos com 35 dias de tumor.  
O perfil de citocinas pró-inflamatórias apresentado em nossos experimentos 
contradiz diversos trabalhos que demonstram aumento da expressão dessas 
citocinas associado à obesidade e ao desenvolvimento de tumores. No entanto, é 
possível que a leptina, aliada a outras alterações, seja a principal molécula 
associada ao maior volume e peso do tumor nos animais obesos, e também uma 
molécula modulatória importante nas metástases ósseas observadas nestes 
animais, visto que alguns estudos têm demonstrado uma correlação entre maior 
expressão do receptor de leptina (Ob-R), altos níveis de leptina e pior progressão 
tumoral. Em 2004, Ishikawa, Kitayama e Nagawa ao avaliarem amostras de 
pacientes observaram que 83% das amostras de carcinoma ductal invasivo 
expressavam o receptor Ob-R, além de uma super expressão leptina em 91% dos 
casos e desenvolvimento de metástases em 34% dos pacientes cujas amostras 
expressavam Ob-R. Wazir e colaboradores, em 2012, também observaram maior 
expressão de leptina e seu receptor em amostras de câncer de mama, 
demonstrando que a leptina desempenha um papel significativo no processo de 
59 
 
carcinogênese da mama. Park e colaboradores, em 2010, ao avaliarem a ação 
fisiológica da leptina periférica no microambiente tumoral, observaram que na 
ausência do Ob-R, há uma diminuição da fosforilação de resíduos de tirosina e um 
aumento da fosforilação de resíduos de serina, preservando a função mitocondrial e 
prevenindo, desta forma, a agressividade tumoral. Também foi observado por 
Frankenberry e colalaboradores (2006) que altos níveis de leptina circulante 
contribuem para a proliferação do câncer de mama, ativando vias de sinalização de 
MAPK e PI3K, envolvidas no crescimento e na sobrevivência celular. Vale ressaltar 
que os níveis de adiponectina podem influenciar diretamente a relação entre leptina 
e pior prognóstico tumoral dos animais obesos. Contudo, acreditamos fortemente 
que, em nosso modelo de estudo, a leptina desempenha um papel central no 
estabelecimento do tumor e no desenvolvimento de metástases, o que nos leva a 
desenhar o seguinte esquema: 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 23: Aumento dos níveis séricos de leptina pode favorecer o estabelecimento do tumor e o 
desenvolvimento de metástases. Animais alimentados pela HFD durante 16 semanas de dieta 
apresentam tumores de maior peso e maior volume, aumento de metástases ósseas e diminuição 
dos níveis das citocinas pró-inflamatórias IL-6 e TNF-α após a disseminação do tumor.  
60 
 
6 CONCLUSÃO 
 
 
 Os resultados obtidos com este trabalho nos permitem concluir que a ingestão 
de uma dieta rica em lipídeos por um longo período é capaz de induzir alterações 
metabólicas características de quadros de obesidade em camundongos BALB/c 
fêmeas e pode aumentar a progressão do câncer de mama, aumentando o número 
de metástases ósseas e a mortalidade associada a este câncer. Neste sentido, a 
obesidade atua como um fator de pior prognóstico neste tipo de patologia, podendo 
ser a leptina uma importante adipocina moduladora do estabelecimento tumoral e 
metástases. Entretanto, estudos que avaliem os mecanismos celulares e as 
possíveis vias de sinalização envolvidas na migração e proliferação das células 
tumorais em animais obesos ainda se fazem necessários.  
 
61 
 
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 
 
 
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