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Clase: Tese
Título : Produção e avaliação de modelos de cultivo celular para teste de RNAs guia para o sistema CRISPR-Cas9
Autor(es): Souza, Gustavo Torres de
Orientador: Camargo, Luiz Sérgio de Almeida
Co-orientador: Hell, Rafaela Chitarra Rodrigues
Miembros Examinadores: Maranduba, Carlos Magno da Costa
Miembros Examinadores: Santos, Marcelo de Oliveira
Miembros Examinadores: Saraiva, Naiara Zoccal
Resumo: Contexto: O sistema de edição gênica CRISPR-Cas9 tem se mostrado uma ferramenta poderosa para modificações genéticas direcionadas. Esta tese de doutorado buscou otimizar o sistema CRISPR-Cas9 para utilização em linhagens celulares bovinas e embriões. Métodos: Foram desenhados e produzidos sgRNAs específicos visando loci de interesse para edição gênica em células epiteliais mamárias bovinas (MDBK). Adicionalmente, células MDBK expressando estavelmente a proteína Cas9 foram geradas. A atividade dos sgRNAs foi avaliada in vitro, e RNA mensageiros (mRNA) reportadores foram utilizados para confirmar a eficiência da transfeção. A seleção por antibiótico foi empregada para promover a expressão estável da Cas9 em linhagens celulares humanas e bovinas. A eficiência da edição gênica em embriões também foi avaliada por meio de PCR e sequenciamento.Resultados: A avaliação in vitro da atividade dos sgRNAs em células MDBK demonstrou variações na eficiência de edição, destacando a necessidade de linhagens celulares expressando a Cas9 com genomas relevantes. O método do mRNA reportador demonstrou sua utilidade para confirmar a eficiência da transfeção. A seleção por antibiótico promoveu com sucesso a expressão estável da Cas9 em linhagens celulares humanas e bovinas. A edição gênica em embriões resultou em uma proporção total de edição de 48%, sendo a maioria das células mutantes (35,5%) apresentando uma deleção de um nucliotídeo. Conclusão: Os sgRNAs desenhados permitiram a edição gênica em linhagens celulares bovinas MDBK, e o modelo otimizado do sistema CRISPR-Cas9 mostrou-se eficaz para editar os loci alvo em embriões. Esses resultados contribuem para o avanço da engenharia do genoma bovino, oferecendo aplicações potenciais em futuros estudos envolvendo o sistema CRISPR-Cas9 para a edição do genoma bovino.
Resumen : Background: The CRISPR-Cas9 gene editing system has emerged as a powerful tool for targeted genetic modifications. This doctoral thesis aimed to optimize the CRISPR-Cas9 system for use in bovine mammary epithelial cells (MDBK) and embryos. Methods: Specific sgRNAs were designed and produced to target loci of interest for gene editing in MDBK cells. Additionally, stable Cas9- expressing MDBK cells were generated. In vitro evaluation of sgRNA activity was conducted, and mRNA reporters were utilized for transfection efficiency confirmation. Antibiotic selection was employed to promote stable Cas9 expression in human and bovine cell lines. The efficiency of gene editing in embryos was also evaluated through PCR and sequencing. Results: The in vitro evaluation of sgRNA activity in MDBK cells showed variations in editing efficiency, emphasizing the need for cell lines expressing Cas9 with relevant genomes. The mRNA reporter method demonstrated its usefulness for confirming transfection efficiency. Antibiotic selection successfully promoted stable Cas9 expression in human and bovine cell lines. Gene editing in embryos resulted in a total editing proportion of 48%, with the majority of mutant cells (35.5%) exhibiting a single-nucleotide deletion. Conclusion: The designed sgRNAs enabled gene editing in MDBK bovine cell lines, and the optimized CRISPR-Cas9 model was effective for editing the target loci in embryos. These findings contribute to the advancement of bovine genome engineering, offering potential applications in future studies involving the CRISPR-Cas9 system for bovine genome editing.
Palabras clave : Edição gênica
Engenharia genética
Transgenia animal
AGMs
CRISPR-Cas9
Beta-lactoglobulina
Receptor de prolactina
Embriões
Gene editing
Genetic engineering
Animals
Transgenics
GMAs
Beta-lactoglobulin
Prolactin receptor
Embryos
CNPq: CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::GENETICA
Idioma: por
País: Brasil
Editorial : Universidade Federal de Juiz de Fora (UFJF)
Sigla de la Instituición: UFJF
Departamento: ICB – Instituto de Ciências Biológicas
Programa: Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas: Imunologia e Doenças Infecto-Parasitárias/Genética e Biotecnologia
Clase de Acesso: Acesso Aberto
Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Brazil
Licenças Creative Commons: http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/br/
URI : https://repositorio.ufjf.br/jspui/handle/ufjf/15793
Fecha de publicación : 30-ene-2023
Aparece en las colecciones: Doutorado em Ciências Biológicas - Imunologia e Doenças Infecto - Parasitárias/Genética e Biotecnologia (Teses)



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