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Tipo: Tese
Título: Ocorrência de splicing alternativo e polimorfismos de base única na sequência do receptor de hormônio luteinizante e relação com o desenvolvimento folicular em Bovinos Leiteiros
Autor(es): Viana, Sabine Wohlres
Primeiro Orientador: Machado, Marco Antonio
Co-orientador: Viana, João Henrique Moreira
Membro da banca: Camargo, Luiz Sérgio de Almeida
Membro da banca: Dode, Margot Alves Nunes
Membro da banca: Guimaraes, Simone Eliza Facioni
Resumo: O objetivo geral deste estudo foi investigar variações genômicas e transcriptômicas do receptor de hormônio luteinizante (LHR) e seu papel nos processos de dominância folicular e resposta à superovulação em bovinos. Foram realizados três experimentos, sendo que em todos se utilizou cDNA sintetizado a partir do RNA total extraído de células da granulosa (CG) folicular. Para a caracterização do transcrito do LHR, CG foram recuperadas de folículos dominantes de vacas das raças Gir (n=16) e Holandês (n=16). Após a PCR e o sequenciamento, os dados foram analisados para a presença de polimorfismos, frequência alélica, conteúdo de informação polimórfica (PIC) e Equilíbrio de Hardy-Weinberg (HWE). Vinte e um polimorfismos de base única (SNPs) foram identificados, sendo 17 em Gir e 14 em Holandês. A classificação dos SNPs de acordo com os valores de PIC identificou 12 como altamente informativos em Gir e cinco em Holandês. Em relação a HWE, oito SNPs não estavam em equilíbrio em Gir e 10 em Holandês. Duas isoformas derivadas de splicing alternativo também foram identificadas, uma no éxon 1 e outra no éxon 10. Conclui-se que o LHR em bovinos leiteiros apresenta uma alta frequência de polimorfismos e múltiplas isoformas. Para avaliar o papel das isoformas do LHR nas CG durante a divergência folicular, a emergência da onda folicular foi sincronizada em novilhas Gir (n=10) e Holandês (n=10) e os folículos foram aspirados individualmente em diâmetros correspondentes aos períodos de pré-divergência, divergência, e pós-divergência. A expressão relativa das isoformas de LHR foi determinada por PCR em Tempo Real e os resultados foram relacionados com as concentrações intrafoliculares de estradiol (E2if). Em ambas as raças, houve um aumento progressivo na concentração de E2if ao longo do desenvolvimento folicular. O E2if foi maior em Holandês quando comparado com Gir antes, durante, e depois da divergência; mas foi similar em folículos de mesmo diâmetro nas duas raças. Observou-se um pico de expressão de LHR total após o início da divergência folicular. A expressão das isoformas de LHR foi ou baixa (Holandês) ou sub-regulada (Gir) durante este mesmo período. Os resultados sugerem que a divergência precoce do folículo dominante em raças de Bos indicus podem estar relacionados à maior sensibilidade ao feedback negativo do estradiol. Além disso, mudanças sequenciais na expressão das isoformas de LHR podem regular a função do LHR durante da divergência folicular em bovinos. A avaliação do comportamento das isoformas de LHR durante a indução exógena do crescimento folicular foi realizada em novilhas Gir caracterizadas com boa (n=5) ou má (n=5) resposta à superovulação. Em ambos os grupos, foram coletadas CG de folículos (8 mm) cujo crescimento ocorreu sem (Controle) ou com estimulação por FSH (SOV). No grupo de boa resposta, não houve diferença na expressão de LHR total entre os tratamentos Controle e SOV. No grupo de má resposta, a expressão de LHR total foi menor em SOV comparado com Controle, mas não houve diferença na expressão das isoformas. Conclui-se que o LHR é diferencialmente expresso em folículos dominantes de novilhas caracterizadas com boa ou má resposta a superovulação.
Abstract: The aim of this study was to evaluate genomic and transcriptomic variations at the luteinizing hormone receptor (LHR) and its role at the follicular dominance establishment and superovulation outcome in bovine. Three experiments were performed, and for all evaluations cDNA synthesized from total RNA extracted from follicular granulosa cells (GC) were used. To characterize the LHR transcript, GC were recovered from dominant follicles from Gir (n=16) and Holstein (n=16) cows. After PCR and sequencing, data were analized to identify polymorphisms, allelic frequency, polymorphic information content (PIC) and Hardy-Weinberg Equilibrium (HWE). Twenty one single nucleotide polymorphism (SNP) were identified, being 17 in Gir and 14 in Holstein. The classification of SNP according to PIC values identified 12 as highly informative in Gir and five in Holstein. Considering HWE, eight SNP were not in equilibrium in Gir and 10 in Holstein. Two isoforms were also identified, one in exon 1 and other in exon 10. We concluded that LHR in dairy cattle shows a high frequency of polymorphism and multiple isoforms. To evaluate the LHR isoforms role in GC during follicular divergence, the follicular wave emergence was synchronized in Gir (n=10) and Holstein (n=10) heifers and follicles were individually aspirated at the corresponding sizes of pre-, divergence, and post-. The relative expression of LHR isoforms was determined by real time PCR and results were correlated to the intrafollicular estradiol (E2if) concentrations. In both breeds, there was a progressive increase in E2if concentration during follicular development. The E2if in Holstein was higher when compared to Gir before, during, and after divergence; but was similar in follicles of same size in both breeds. We observed a peak for the total LHR expression after the beginning of the follicular divergence. The expression of LHR isoforms was low (Holstein) or under-regulated (Gir) during this same period. The results suggest that the early follicular divergence of the dominat follicle in Bos indicus breeds can be related to a higher sensitivity to the estradiol negative feedback. Besides, sequential changes in LHR isoforms expression can act regulating the LHR function during folicullar divergence in bovine. The evaluation of LHR isoforms behavior during the exogenous induction of follcilualr development was performed in Gir heifer previously characterized as good (n=5) or poor (n=5) responders to superovulation. In both groups, GC were collected from follicles (8 mm) which growth occurred without (Control) or with FSH stimulation (SOV). In good responders group, there was no difference in the LHR expression between the Control and SOV treatments. In the poor responders group, the total LHR expression was lower in SOV when compared to Control, but there was no difference in the expression of the isoforms. We concluded that LHR is differentially expressed in dominant follicles from heifers characterized as good or poor responders to superovulation.
Palavras-chave: Zebu
Dominância folicular
Células da granulosa
Splicing alternativo
Esteroidogênese
Zebu
Follicular dominance
Granulosa cells
Alternative splicing
Steroidogenesis
CNPq: Genética e Biotecnologia
Idioma: por
País: Brasil
Editor: Universidade Federal de Juiz de Fora
Sigla da Instituição: UFJF
Departamento: ICB – Instituto de Ciências Biológicas
Programa: Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas: Imunologia e Doenças Infecto-Parasitárias/Genética e Biotecnologia
Tipo de Acesso: Acesso Aberto
URI: https://repositorio.ufjf.br/jspui/handle/ufjf/102
Data do documento: 27-Jan-2015
Aparece nas coleções:Doutorado em Ciências Biológicas - Imunologia e Doenças Infecto - Parasitárias/Genética e Biotecnologia (Teses)



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